第五章固定化酶及固定化技术.ppt

第五章 固定化酶及固定化技术 酶： 在水溶液中－不稳定 一次性使用-难回收，难连续化生产 用于医药/化学分析－纯度要求高 产物的分离纯化困难 。。。。 －－－要求将酶变成不溶性 －－－实际上将酶限制在一定空间? 固定化 固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发挥催化作用的酶制剂。 酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合（化学偶联）及包埋等多种方法。 简 史 1916年，Nelson Griffin “酶不溶于水而具有活性” 1948年，Sumner 尿素酶制成非溶性酶 1953年，Grubhofer Schleith 第一次实现了酶的固定化 1960年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究 1969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于DL-AA的光学分析上 1971年，固定化酶名称提出，Immobilized enzyme 1973年，固定化微生物的应用——固定化大肠杆菌中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天冬氨酸 1976年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精 1978年，日本用固定化细胞生产酶——固定化枯草杆菌生产淀粉酶 1979年，固定化植物细胞和动物细胞开始研究 1982年，日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸 1986年，郭勇等人固定化原生质研究 二、固定化酶的优缺点： 稳定性高； 酶可反复使用； 产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物分开； 固定化酶的反应条件易于控制 生产可连续化和自动化，节约劳动力； 设备小型化、可节约能源。 缺点： 固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大 固定化时，酶活力有损失 长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活 只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜 与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应 三、固定化酶制备 必须注意维持酶的催化活性及专一性。 酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸残基不发生变化） 避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。 固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。 固定化酶应有最小的空间位阻。 酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。 酶的固定化方法 —— 指通过氢键、疏水作用、电子亲和力等物理作用，将酶吸附到固体吸附剂表面的方法。 优点：操作条件温和，固定化时酶分子的构象 较少或者不变化；载体廉价易得 缺点：结合力弱，易解吸附 选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。 2. 结合法 离子键结合法 是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法。 阴离子交换剂：DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶，Amberlite IRA-93，410，900；阳离子交换剂：CM-纤维素，Amberlite CG-50，IRC-50，IR-120，Dowex-50等。 例：采用天然高分子聚合物几丁质作载体，以戊二醛为交联剂，通过化学交联反应将纤维素酶固定在几丁质上，在戊二醛浓度1.25%，pH值4.0时固定纤维素酶，该固定化酶的半衰期为60天。用于降解壳聚糖，效果明显。 交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低，但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。 单独使用交联法所得到的固定化酶颗粒小、机械性能差，酶活低，故常与其他方法联用 4.包埋法 是指将酶或含酶微生物包裹在多孔的载体中。 网格型； 微囊型。 微囊型 微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。 酶的固定化模式 各类固定化方法的特点比较: 固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题 ： 酶的活性中心发生物理化学变化导致酶活力降低 酶固定化后多了空间屏障,增加了传质阻力 酶和载体结合不牢固,容易脱落,酶活力损失大 固定化颗粒成型困难 固定化技术的改进 定点固定化技术 抗体偶联、生物素－亲和素亲和、氨基酸置换（Cys） 多酶系统的共固定化 多种酶同时固定在膜材料上,利用各自的功能协同催化复杂的生物转化过程 新型的固定化技术 高分子技术、纳米技术、光、辐射等作用 加入表面活性剂 可使酶活性大幅度提高，最高的达100?倍，并增加了酶使用次数 等等 固定化对反应系统的影响 不同制备方法，对酶反应