基因敲除专题.pptVIP

Parp3 -/- CH12 cells via CRISPR/Cas9 CH12F3 CH12F3Lig4-/- CH12F3Lig4-/-Parp3-/- A1 CH12F3Lig4-/-Parp3-/- A2 CH12F3Lig4-/-Parp3-/- A10 CH12F3Lig4-/-Parp3-/- F3 CH12F3 CH12F3Lig4-/- CH12F3Lig4-/-Parp3-/- A10 CH12F3Lig4-/-Parp3-/- F3 CRISPR/Cas9 应用举例 动物： 小鼠 奶牛 … 人 植物： 拟南芥 水稻 小麦 … 通过CRISPR/Cas9对小鼠癌细胞突变 CRISPR/Cas9对人基因组的编辑 CRISPR/Cas9在植物中的应用 * * 条件性基因敲除的基因重组及切除步骤 2.1.4 同源重组基因敲除缺点 ( 1)操作复杂, 实验周期长, 费用偏高; ( 2)在敲除过程中, 被破坏的常常只是靶基 因的部分外显子而并不是整个编码区, 残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能, 这将给表型分析带来麻烦; ( 3)对于某些必需基因, 敲除后会造成细胞死亡, 也就无法研究这些必需 基因的功能; ( 4)由于基因功能上的冗余, 敲掉一个基因并并不能造成容易识别的表型, 基因家族的其他成员可以提供同样的功能; ( 5)同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除,获得的表型差异很大。 总的来说, 基因敲除小鼠模型的建立周期长、技术含量高、风险性大。至今国内外仍没有在基因打靶方面取得突破性进展使得此技术能够满足快速化、高通量研究基因功能的要求。 2.2 利用随机插入突变进行基因敲除 原理： 此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。 需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白 2.2.1 基因捕获法 基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法。 基因捕获法的基本原理图 2.2.2 基因捕获法的优缺点 利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的 ES 细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。 缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。 2.3 RNAi 由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中。近年来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更为简单方便的方法。 RNAi阻断基因表达的机理图 ①、②：双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面双链RNA还能在RdRP（以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RNA directed RNA polymerase，RdRP）的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。 ③ ：siRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。 ④：上述复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。 ⑤：这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。 2.3.2 RNAi的优缺点 contents CRISPR-Cas9 System 3.基因敲除技术的应用及缺陷 ①．建立生物模型。在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。 ②.疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。 ③.提供廉价的异种移植器官。众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用