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微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 微生物限度检查方法的验证 包括: 1.细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证——准确性（回收率） 2.控制菌检查法的验证——专属性 3.实例 一、细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 1.验证的目的： 确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定。照 此检查法和检验条件进行供试品细菌、霉菌、酵母菌数检查能保证检验 结果的准确、可靠。 2.验证的步骤： •根据样品特性，制定检验方法和检验条件。 •保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试验要求。 •按制定的方法进行试验。 •根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按验证的方法和条 件进行药品的微生物限度检查；若不符合，应重新设立验证方案，再进 行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法 及要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进 行3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 3. 验证用菌株： 细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。 霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。 第 1 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准菌株(或该药品中 常见的污染菌)。 菌种的要求：不得超过5 代。采用适宜的方法保存。加菌量:50～100cfu。 4.验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、中和法、离心 沉淀法、联合方法。 5.样品稀释级的选择：最低稀释级，1g 或1ml。 6.培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、营养肉汤培养 基、改良马丁琼脂培养基。 7.菌液制备 (1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养 物至 10ml营养肉汤中，35～37℃培养 18～24 小时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10 倍递增稀释法，稀释至10-5 -7 ～10 ， 使菌数约为50～100cfu/ml。 (2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至 10ml改良马丁培养基中，23～ 28℃培养 18～24 小时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml， 采用10 倍递增稀释法，稀释至10-5 -7 ～10 ，使菌数约为50～100cfu/ml。 (3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上， 23～ 28℃培养 5～7 天，加3～5ml0.9％无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出 菌液，取 1ml菌液加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10 倍递增稀释法， 稀释至10-4 -6 ～10 ，使菌数约为50～100cfu/ml。 8.供试品的处理： 固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml 供试品+稀释剂至100ml 抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或薄膜过滤。 第 2 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 • 菌液组 • 供试品对照组 • 试验组 • 稀释剂对照组 每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。 8.1 菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的 1ml 菌液（约 50～100cfu），分别注入平皿中，立 即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌 落数