基因工程的主要技术与原理-核酸分离-电泳.ppt

生物技术专业核心课程 细菌的培养 细菌的收集和裂解 质粒DNA的分离和纯化 优点： （1）便于分离； （2）便于检测； （3）便于回收。 一、核酸凝胶电泳的基本原理 核酸分子骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态； 核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正 电极方向迁移； 一、琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis （二）DNA的迁移速率决定因素 双链DNA分子迁移的速率 与其碱基对数的常用对数 近似成反比； 不同类型琼脂糖的性质 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 5.所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比； TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较 （三） 凝胶载样缓冲液 6×凝胶载样缓冲液 （四）琼脂糖凝胶中DNA的检测 1.凝胶的EB染色 使用EB染色注意事项 （1）EB被认为是一种强致癌物质 2 凝胶SYBR Gold的染色 SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。 其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极 大增强荧光信号。 （五） 凝胶中DNA的成像 （六） 凝胶中DNA的回收 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE 在四甲基乙二胺(TEMED)催化过硫酸铵还原产生的 自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚 丙烯酰胺的线状长链。 CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺） （二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1.变性聚丙烯酰胺凝胶 2.非变性聚丙烯酰胺凝胶 （三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围 三、 脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresisPFGE （一） PFGE 工作的基本原理 （二）PEGE类型 垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) 场翻转系统(field inversion) 旋转胶系统(rotating gel) 箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field) （三） 影响分辨率的因素 1.脉冲时间(0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较 大分子，减少脉冲时间分离较小分子。 3.电场夹角：电场方向的夹角常为1100-1200， 研究证实900夹角也非常有效的。 DNA的迁移速率决定因素 PFGE工作的基本原理 （一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质 在双功能交联剂如N，N′-亚甲双丙烯酰胺的参与 下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状 网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联 剂的浓度。 用于单链DNA片段的分离或纯化、DNA测序 反应等。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其 碱基组成及序列完全无关，只与分子大小有关。 迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用于双链DNA片段的分离和纯化、制 备高纯度的DNA片段。 12 45 5~100 20.0 15 60 25~150 15.0 20 70 50~200 12.0 45 160 60~400 8.0 65 260 100~500 5.0 100 460 1000~2000 3.5 溴酚蓝 二甲苯氰FF 有效分离范围（bp） 丙烯酰胺浓度（%） 注:N,N`-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30; 聚丙烯酰胺凝胶装置 1984年，Schwartz和Cantor发明 该法可分离长至107bp的DNA分子。严格说来， 应叫交替电场凝胶电泳。 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替 进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出 反应所需的时间取决于它的大小。 B+ A- +A -B 脉冲电场电泳示意图 A- +A B- +B 垂直或横向交变系统 场翻转系统 箝位匀强电场系统 旋转胶系统 A- +A B- +B A- +A B- +B - + 2.电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大 了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度 会导致较小片段泳动的紊乱。 4.温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE 一般应在4℃进行。较高的温度DNA泳动较快；但 是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显 的条带变宽。 2)??硅胶膜纯化法： RNeasy试剂盒由Qiagen公司设计，其设计思路与 DNA纯化思路相似； 当含有目的RNA的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNA 被吸附在硅胶膜上，从而与其它成分分开； 在低盐浓度条件下，RNA被洗脱