小鼠肝细胞彗星试验和Ames试验用于饮用水遗传毒性检测的比较.docVIP

PAGE PAGE 1 单细胞凝胶电泳试验和Ames试验对饮用水遗传毒性的检测 张崇华 王春莲 句立言 哈尔滨市疾病预防控制中心，哈尔滨 150056 电子邮箱：chonghua_zhang@163.com 摘要: 　 目的　比较单细胞凝胶电泳试验 (彗星试验，SCGE) 和Ames试验在水质遗传毒性检测中的灵敏性与优缺点，建立水质遗传毒性检测体系。　 材料与方法　　正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖、二甲基亚砜、肌氨酸钠、乙二胺四乙酸二钠、Tris、TritionX-100（均购自凯美康公司），鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株TA98 与TA100（购自美国加州大学Ames实验室）。采用Ames 试验和小鼠原代肝细胞凝胶电泳试验分别对H市的S、M两处水源水的有机浓集物的遗传毒性进行检测，对结果进行分析。 结果 M水源两种方法检测结果与阴性对照组间无显著性差异，无遗传毒性。 S水源Ames 试验于试样浓度为7 L/ 皿时表现为阳性结果, 而SCGE在水样量为0.25 L时出现阳性结果(与阴性对照比P 0.01) ,前者的浓度是后者的28倍。说明S水源具有遗传毒性。对于遗传毒性的检测,SCGE比较敏感,适用于低剂量致变因子遗传毒性的检测分析。 结论　SCGE 与Ames 试验分别从不同的遗传毒作用终点对致变剂遗传毒性进行检测。SCGE对DNA 的损伤更敏感,可反映低剂量致变剂在较短时间内造成的DNA 损伤。而Ames则反映致变剂的最终损伤作用,其结果稳定可靠,两种方法结合进行检测,有利于增加检测的敏感性与可靠性,更全面、准确地反映环境致突变因子的遗传毒性。 关键词: 　单细胞凝胶电泳试验; Ames试验;遗传毒性; 　　近年来,由于各种环境污染物向水体的大量排放给水质造成的影响,导致水中的有机污染物的种类和数量急剧增加,对人类健康造成严重威胁。为了解本市生活饮用水污染状况以及污染物的潜在危害性,本研究采用Ames 试验和小鼠肝细胞彗星试验,对我市主要水源水的有机浓集物进行了致突变检测,比较了两方法的敏感性，分析两种方法在遗传毒性检测中的优缺点。为改善水质、控制污染,增进市民健康等提供科学依据。 1 　材料和方法 1. 1 　材料　正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖、二甲基亚砜、肌氨酸钠、乙二胺四乙酸二钠、Tris、TritionX-100（均购自凯美康公司），鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株TA98 与TA100（购自美国加州大学Ames实验室）。 1. 2 　方法 1. 2. 1 　 采集两个水源地水各500L, 用固相萃取法[1] 将水样经处理后的GDX-102大孔树脂富集其中的有机物，用经两次重蒸已除去过氧化物的乙醚洗脱,无水硫酸钠脱水,KD 浓缩器浓缩，用二甲基亚砜定容, 使1 ml定容液相当于250L水样，贮于 1. 2. 2 　小鼠原代肝细胞凝胶电泳试验　小鼠股动脉放血后颈椎脱臼处死,取出全部肝脏,放在滤纸上除去被膜及血迹后放小平皿内,加入少量预冷的PBS 液,用眼科剪剪碎后,经110 目的不锈钢筛网过滤,收集细胞悬液。以PBS 液调细胞浓度至107～108 个/ ml ,置冰浴待用。按悬浮染毒方法进行染毒[2] 。取上述制备好的细胞悬液按每管105～106 个细胞分装于10ml 刻度离心管, 于每管中分别加入不同浓度的水样有机提取物100μl,再以PBS 液将体积加至5 ml，使终浓度相当于每管含125、250、500 ml 原水样, 每个剂量设2 个平行样,同时设试剂对照（DMSO100μl）和阳性对照(K2Cr2O70.2 mmol/L 100μl) 混匀后置37 ℃恒温水浴，振荡染毒1 h ,染毒完毕于1500 转/ min 离心5 min , 弃掉上清液, 再以PBS液洗2 次, 加200μl PBS 液重悬细胞用于彗星试验。按常规彗星试验方法[3]检测。试验以平均细胞拖尾长度和拖尾率为检测指标, 每张载玻片随机计数50 个细胞, 计算细胞的拖尾率和平均尾长。采用SPSS软件,对细胞拖尾率进行χ2 检验,对拖尾细胞DNA 1. 2. 3 　 Ames 试验　按照Ames试验的操作程序[4]进行平皿掺入法试验。菌株采用鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株TA98 与TA100 ,并经四步法鉴定合格,样品浓集物以DMSO 为溶剂, 每个水样浓集物设4个剂量,分别为1L /皿、3L /皿、5L /皿、7L /皿(即相当于每皿1、3、5 L 、7 L原水样)。取不同浓度水样浓集物0.1 ml,新鲜菌液0.1 ml,融化顶层2 ml,混匀后铺在底层培养基上, 37℃孵育48 h,计算每皿的回变菌落数。阳性对照选用敌克松(62.5 μg/ 皿) ,被测试水样每个剂量组设3皿平行