浙江大学细胞培养_基本的技术.pptVIP

聚光器 FAA固定液： 90 ml80%的酒精中加入冰乙酸和40%甲醛各5 ml Carnoy固定液： 60 ml纯乙醇中加入氯仿30 ml及冰乙酸10 ml Bouing固定液： 75 ml饱和苦味酸（100 ml水中加入1.2-1.4 g）过滤，加入25 ml福尔马林（40%甲醛，有沉淀时禁用），再加入5 ml冰醋酸（最好用前加） 4%多聚甲醛-PBS： 50 ml蒸馏水中加入4 g多聚甲醛，加热至60-70 oC，边搅拌边逐滴加入2 M的NaOH至液体清澈透明；用1 M的HCl调pH至7.4，冷却后加入10 mM的PBS至100 ml 锇酸： 在棕色试剂瓶中加入50-100 ml的0.1 M PBS（pH 7.0-7.4），再将装有1 g锇酸的安培瓶放入，击碎安培瓶，摇晃使锇酸溶解 2.2 染色方法 染色是利用化学染料与细胞及各种细胞器发生化学作用和/或吸附作用，使各种细胞结构能够通过染色而改变其折射率，从而清晰的显现出来。 影响因素： 所用的固定液 染液的pH值：组织的酸性成分用pH偏高的染液，碱性成分用偏酸染液 1）Giemsa染色 简便、快速，适用于多种细胞和染色体染色 染色液现用现配，保存时间最好不超过48 h；Giemsa液对pH敏感。 母液制备： Giemsa粉0.5 g，甘油22 ml，在研钵内将少量甘油和Giemsa粉混合研磨至无颗粒，加入剩余甘油，56 oC保温2 h，加入33 ml甲醇，棕色瓶保存。 1）Giemsa染色 染色步骤 （盖片培养或涂片法）： 1）Sorensen buf和Giemsa染液9:1体积比混合即得到染色液 2）用甲醇固定细胞标本10 min，或醋酸/甲醇(1:3)固定30 min 3）用滴管将染色液布满材料面（不要有气泡） 4）染色10-15 min，用自来水将玻片冲洗干净，空气干燥，二甲苯透明 5）光学树脂胶封片后观察 结果： 细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色 2）苏木精-伊红染色 染液制备： 1）苏木精染液(20×): 苏木精0.5 g，铵矾(NH4)2SO4Al2(SO4)3 24g，H2O 50 ml，NaIO3 0.5 g，甘油30 ml，冰醋酸2 ml。 2）1%伊红染液： 1 g伊红溶于100 ml蒸馏水。 2）苏木精-伊红染色 染色步骤 （盖片培养法）： 1）37 oC温PBS中漂洗3次，每次20-60 sec，中性福尔马林固定30 min 2）蒸馏水漂洗1次，用蒸馏水稀释的1×苏木精染液染色10 min，自来水洗后置入1%NaHCO3中漂洗至蓝紫色 3）伊红水溶液中染0.5-1 min，蒸馏水洗后迅速通过丙酮2次，每次3-5 min 4）通过2:1和1:2丙酮/二甲苯各3次，每次1-2 min；纯二甲苯5-10 min 5）用光学树胶封片（注意勿将盖片的细胞面放反）后观察 结果： 细胞核染成红色，胞质染成蓝紫色 3）吖啶橙染色 吖啶橙(acridine roange, AO)： 常用荧光染料，可用于活细胞、固定细胞染色，可与细胞中DNA和RNA结合而发出不同颜色的荧光，DNA亮绿色，RNA橘红色至火红色。快速、简便、并有一定特异性。 染液配制： 用生理盐水将AO配成1%的母液，冰箱保存，用时则0.1 M的PBS（pH 4.8）稀释成0.01%工作液。 3）吖啶橙染色 染色步骤 （盖片培养）： 1）Hank’s液洗盖玻片上的贴壁细胞3次 2）用95%乙醇固定细胞标本15-30 min，滤纸吸干 3）1%醋酸作用30 sec，PBS清洗1 min 4）用0.01%的AO染液染色1-5 min，PBS清洗1 min 5）0.1 MCaCl2分色0.5-2 min，PBS清洗3次，每次数秒 6）1:1的甘油:PBS封片，立刻观察(用激发波405的滤光片) 4）免疫荧光染色 原理： 用荧光素标记已知抗体或抗原，检查细胞或组织标本中相应的抗原或抗体。在荧光显微镜下，抗原抗体特异性结合部位的荧光素受激发光照射而发出明亮的荧光。 荧光素： 异硫氰酸荧光素（FITC）：发射荧光波长为490-619 nm（黄绿色荧光） 四乙基罗丹明（RB200）：发射荧光波长为540-660 nm（橙红色荧光） 4）免疫荧光染色 染色步骤 （间接荧光染色法）： 1）用95%乙醇固定单层细胞标本10-30 min，或冷丙酮固定5-10 min， PBS洗3次，每次5 min，边洗边震荡 2）滴加未标记的一抗液，37 oC湿盒中30 min， PBS洗3次，每次5 min，边洗边震荡 3）滴加荧光标记二抗， 37 oC湿盒中30 min，PB