单细胞凝胶电泳标准操作规程(本室SOP).pdfVIP

中国试剂网 3.26.11 单细胞凝胶电泳标准操作规程(本室SOP) 原理： 在细胞核中，DNA 是环状附着在核基质上，细胞裂解过程中，核基质被溶解、 抽提，DNA 的结构则未发生变化。如果DNA 链上存在缺口，则使DNA 超螺旋 变的松弛，DNA 环向外展，同时由于暴露了阴电荷，在电场力的作用下，松动 的DNA 环向阳极迁移，但是由于这种松动的DNA 环一端仍附着于核DNA ，其 迁移距离受到限制，因此尾长并不总是真实反映链缺口的多少。实际应当依靠尾 长与尾部的荧光强度同时来进行分析。 操作步骤： 1. 分离制备单细胞悬液： （1） 体外培养的细胞株：用胰酶消化，吹打成单细胞悬液 （2 ） 体内脏器细胞：处死动物，取出脏器，于 Hanks’液中制备成单个细胞悬 液。 2. 胶板制备： （1） 取20~50μl 于56℃水浴中保温的0.5%普通熔点琼脂糖，铺于磨沙载玻片 上，形成底胶。 （2 ） 取100~150μl 0.5%普通熔点琼脂糖加在底胶上，再于其上加盖玻片，4 ℃ 冷凝10 分钟。 （3 ） 取下盖片，取 50~100μl 于 37 ℃水浴中保温的 1.0%的低熔点琼脂糖与 50~100μl 细胞悬液（105 个细胞/ml ）混匀，立即铺片，加上盖玻片，4 ℃冷凝10 分钟。 （4 ）去掉盖玻片，取70~100μl 于37℃水浴中保温的0.5% 的低熔点琼脂糖铺片， 加盖玻片，4 ℃冷凝。 3. 细胞裂解与电泳： （1）将制备好的胶板去掉盖玻片后，浸于4 ℃预冷的细胞裂解液中，4 ℃裂解1 中国试剂网 3.26.11 小时。 （2 ） 取出胶板，放入电泳槽中，浸泡在电泳液中解旋20 分钟。 （3 ） 4 ℃电泳20 分钟（25V ，300mA ）。 4. 中和与染色： （1） 电泳结束，将胶板浸泡于中和液中，每次15 分钟，共中和两次，注意更 换中和液。 （2 ） 取出胶板，置于染色架上，滴加5μg/ml 的PI ，暗处染色20 分钟。 （3 ） 蒸馏水脱色15 分钟。 5. 镜检和分析： （1） 在荧光显微镜下观察，绿光激发吸收滤片590nm。必要时照相记录。 （2 ）记数观察的细胞，记录彗星细胞出现的频率，用目镜测微尺测头长与全长， 计算核DNA 迁移距离。 * * * * * 使用两层凝胶法，经裂解、DNA 解旋、电泳和中和得到湿琼脂糖凝胶片。将湿 琼脂糖凝胶片置于冰冷无水乙醇中脱水 10 分钟，后置于空气中自发干燥。每人 制备2 张琼脂糖凝胶片。全部操作在采血后8 小时内完成，操作过程中注意避光。 脱水干燥的琼脂糖凝胶片装于含有干燥剂的载片盒中运回实验室。使用 50µl 30µM 的溴乙锭溶液染色、照相。使用单细胞凝胶电泳软件分析所有照片，每人 随机测量100 个以上细胞的尾长和olive 尾矩，以尾长和olive 尾矩的算术均数代 表个体DNA 损伤情况。