利用模拟酶催化显色和等温核酸扩增反应检测特定序列DNA.pdf

第42 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)摇 研究报告 第4 期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2014 年4月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 489 ~494 DOI:10.3724/ SP.J.1096.2014.30752 利用模拟酶催化显色和等温核酸扩增反应检测特定序列DNA 汤薇摇 王 辉摇 王洪红摇 李正平* (陕西师范大学化学化工学院,应用表面与胶体化学教育部重点实验室, 陕西省生命分析科学重点实验室,西安710062) 摘摇 要摇 基于血红素(Hemin)与 G鄄四联体(G4)所形成模拟酶的催化作用,结合等温指数扩增反应(IEX鄄 PAR),建立了特定序列DNA 的显色检测方法。 目标DNA引发IEXPAR,通过设计模板序列,IEXPAR产生大 + 量富含鸟嘌呤的单链DNA,在K 存在时,该单链DNA可形成G4结构,G4可以与Hemin结合形成具有过氧化 物酶活性的模拟酶(Hemin鄄G4),Hemin鄄G4 催化 H O 氧化2,2鄄联氮鄄二(3鄄乙基鄄苯并噻唑鄄6鄄磺酸)二铵盐 2 2 (ABTS),使体系颜色发生变化,反应产物最大吸收波长为421 nm。 对显色反应体系中的实验参数进行了优 化,包括Hemin浓度、ABTS浓度、H O 浓度、IEXPAR时间和显色反应时间。 在最佳条件下,所建立的体系可 2 2 以简便、快速检测0.1~10 nmol/ L 的目标DNA分子,且本方法能够很好地区分单个碱基的差别,具有良好的 特异性。 关键词摇 特定序列DNA 的检测;等温指数扩增(IEXPAR);Hemin鄄G4模拟酶;显色分析 1摇 引摇 言 核酸扩增是实现高灵敏度检测核酸的重要手段。 目前常用的核酸扩增技术是聚合酶链式反应 (Polymerase chain reaction,PCR),但PCR需要精确的热循环和严格的反应条件。 近年来,核酸的等温 [1] 扩增技术得到了迅速发展 。 等温指数扩增反应(Isothermal exponential amplification reaction,IEXPAR) [2] 是Galas等建立的一种新型的核酸扩增技术 。 结合DNA 聚合酶催化的延伸反应及切刻内切酶的剪 6 9 切作用,IEXPAR可以在等温条件下,短时间内对目标核酸分子扩增 10 ~10 倍。 该技术具有简便、快 [3] 速的显著优点,其扩增倍数可与PCR媲美。 目前IEXPAR 已广泛用于特定序列DNA分析 、病毒基因 [4,5] [6,7] [8] 鉴定 、microRNA测定 以及转录因子分析 。 但基于IEXPAR 的核酸分析多采用实时荧光检测 方法,需要昂贵的实时荧光定量PCR等仪器。 + 在K 存在时,富含鸟嘌呤的单链 DNA(G4鄄DNA)通过分子内氢键的相互作用可折叠形成稳定的 G鄄四联体结