免疫荧光染色方法.doc

免疫荧光染色方法 （一）制片 选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。 （二）固定 除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。 标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。 常用抗原物质的固定方法 抗原物质????????? ? 固定剂 ? 固定条件（min） 蛋白质抗原 ? 95%～100%乙醇 ? 室温3～10 酶、激素 ? 丙??酮 ? 4℃??30 免疫球蛋白 ? 四氯化碳 ? ? 病????毒 ? 丙酮、四氯化碳、无水乙醇 ? 室温5～10或4℃?30～60???? 多糖、细菌等?? ? 微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮 ? 室温5～10或4℃30～60 类????脂?????（异嗜性抗原） ? 10%甲醛，10%佛茂尔（ForMol） ? 室温3～10 （三）水洗 固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。 （四）染色 染色分直接染色法与间接染色法。 1． 材料与试剂 （1）荧光抗体，稀释至应用浓度。 （2）0.01Mol/L pH7.4PBS液 （3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。 （4）带盖方盘 2．直接染色法 （1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。 （2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。 （3）蒸馏水冲洗。 （4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。 2． 间接染色法 （1） 检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。 （2） 检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。 （五）结果显示 荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。 荧光强度的表示方法如下： ＋＋＋ ～ ＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。 ＋＋ ：荧光明亮，呈黄绿色。 ＋ ：荧光较弱，但清楚可见。 ± ：极弱的可疑荧光。 － ：无荧光。 （六）标本保存 由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。 保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂（Fluormount）或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。 荧光原位杂交（FISH）实验步骤 仪器设备 ????1、 医用微波炉；???? 2、 水浴锅；???? 3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜；?????4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。FISH试剂??? （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；?????（2）20×SSC（pH7.0）；?????（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；?????（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。?????（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。?????（6）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。实验步骤????1、脱蜡：?????1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；?????2）100％酒精两次，每次2min；?????3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。????2、蛋白酶处理:?????1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒