Luciferase Assay System 简明操作指导.pdfVIP

Quick PROTOCOL Luciferase Assay System 简明操作指导 注意：这是节选操作步骤，详细英文说明书见 适用产品目录号：E1483,E1500,E1501,E1531, /protocols/ E4030,E4530,E4550 I. 需用户自备的材料 • 不透光多孔白板或发光检测管 • 发光检测仪或带发光模块的多功能微孔板读数仪 II. 试剂准备和储存条件 制备萤光素酶检测试剂（LAR）： 1． 将Luciferase Assay Buffer ( 目录号E4550 中的是105ml，其他目录号中的是10ml) 加到含有冻干底物Luciferase Assay Substrate 的瓶中，混合，使底物溶解。为避免反复冻融，请将配好的萤光素酶检 测试剂（LAR）分装成单次使用的小份儿，并将未使用的LAR 储存于–20℃（可保存1 个月）或–70℃（可保存 1 年）。每次使用前需将LAR 平衡至室温（22-25℃）。（不要在高于25℃融化LAR） 注意：必须将整瓶Luciferase Assay Buffer 倒进Luciferase Assay Substrate 瓶中，不可将冻干底物取出称量配制。 2 ．配制1X 裂解试剂：将4 倍体积的水加到1 倍体积的5X 裂解试剂中（Cell Culture Lysis Reagent [CCLR]，目录号 E1531 ；Reporter Lysis Buffer [RLB]，目录号E3971），混合均匀。使用前需平衡至室温。 将Cell Culture Lysis Reagent 储存于-20℃。Reporter Lysis Buffer 可在室温（22-25℃）保存，远离阳光直射处。 III. 操作步骤 1．哺乳动物细胞裂解液的制备和检测 1) 去除培养细胞中的培养基。 2) 用1X PBS 清洗培养细胞，注意不要使细胞脱落。尽量将清洗液去除干净。 3) 将足够覆盖细胞的1X 裂解试剂（CCLR、RLB 或PLB）加到细胞中（例如，400µl/60mm 培养皿, 900µl/100mm 培养 皿或96 孔板20µl/ 孔）。如果使用 RLB ，要做一次冻融循环以保证完全裂解。 4) 将培养皿中的贴壁细胞刮下来，然后把细胞和所有液体转移到一个离心管中。短暂离心（室温12,000 × g 离心15秒 或4℃最多离心2 分钟）以沉淀碎片，然后将上清液转移到一个新管中。 5) 将20µl 细胞裂解液与100µl 萤光素酶检测试剂（LAR）混合均匀，检测发光信号。 2 ．植物组织裂解液的制备和检测 1) 在液氮中快速冷冻植物组织，将冷冻组织研磨成粉末，用室温的1X CCLR 重新悬浮并匀浆。 2) 短暂离心以沉淀碎片，然后将上清液转移到一个新管中。 普洛麦格（北京）生物技术有限公司 电话：800 810 8133 ( 座机拨打)，010 网址： Quick PROTOCOL 3) 将20µl 细胞裂解液与100µl 萤光素酶检测试剂（LAR）混合均匀，检测发光信号。 3 ．细菌细胞裂解液的制备和检测 1) 将40µl 未转化细胞（“carrier cells”）与 50µl 转化的培养物混合。 2) 加入10µl 1M K HPO (PH 7.8), 20mM EDTA 。 2 4 3) 在干冰上快速冷冻混合物，然后将管子置于室温水浴中以使细胞平衡到室温。 4) 加入300µl 新鲜配制的裂解混合物（lysis mix）*，混匀并于室温孵育 10 分钟。 5) 将20µl 细胞裂解液与100µl 萤光素酶检测试剂（LAR）混合均匀，检测发光信号。 * 裂解混合物 （lysis mix）： 1X CCLR 1.25mg/ml lysozyme 2.5mg/ml BSA # ，25mg BSA ，加 以配制10ml 裂解混合物为例：在试管中加入2ml 的5