生物技术概论-基因工程1.ppt

DNA连接酶（ligase） 催化两段DNA之间的连接 pUC19 pUC18和 pUC19 pUC19图 pBluescript II KS/SK pBluescript SK M13mp18/19结构图 多克隆位点MCS λ噬菌体 λ噬菌体的DNA 是双链、线状 (48502?bp)，两端的5’-端有12?个碱基是单链的，碱基互补的。噬菌体DNA注射到菌体内后末端碱基互补而环化。 ~~~~~~ ~~~~~~ Cos site cos site 在噬菌体侵染时，其DNA借助于柯斯位点插入到细菌染色体中，从而实现自身DNA的复制和表达。 Lambda噬菌体载体 cos质粒载体 1、电泳定义：带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。 2、核酸电泳：核酸分子由于带负电荷，在电场中向阳极定向运动。根据核酸电泳的介质可以分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳。 。 (六)碱性磷酸酯酶：催化从DNA两端或一端去除磷酸的酶。 用途：避免该DNA片段首尾相连（环化）。 (一)载体(vector)概念 能够携带外源DNA片段进入受体生物细胞并进行复制或表达的特殊DNA片段。 载体是将基因或其它核酸物质运载到细胞中的工具。 二、载体 (二)载体特征 1．具有多克隆位点(multiple cloning site,MCS) 。 要易于插入转移的核酸片段。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。 2．具有复制起始位点(ori)，能在宿主细胞中复制。 整合复制和自主复制，最好有较高的自主复制能力。 3．有容易被识别筛选的标记。 当其进入宿主细胞能容易被辨认和分离出来。 4．高效进入宿主细胞，易于从宿主细胞中分离纯化。 5. 对宿主和操作者安全。 无毒，不易自然扩散。 Npt II：新霉素磷酸转移酶基因，抗卡那霉素 Hyg: 潮霉素磷酸转移酶基因,抗潮霉素 gentR:庆大霉素抗性 基因，抗庆大霉素 AmpR:氨苄青霉素抗性基因，抗青霉素类 TETR:四环素抗性基因,抗四环素 Gus:催化溴取代葡萄糖转化无色-蓝色反应 Gfp:绿色荧光蛋白，合成绿色荧光蛋白 Lac（z）:催化溴取代半乳糖无色-蓝色转化反应 常用选择标记(编码基因): (三)载体分类 1、根据应用目的： 克隆载体：主要用于外源DNA片段体外复制的载体。 表达载体：除具有克隆载体的作用外，同时可以使外源DNA片段上基因得到表达的载体。 2、根据载体来源 质粒载体：由原核生物(主要是细菌)中的质粒加工改造而成的载体。 噬菌体、病毒载体：由病毒DNA或RNA加工改造成的载体。 柯斯质粒载体：由噬菌体中的柯斯位点和细菌质粒组合改造形成的载体。 (四) 质粒载体 1．质粒(plasmid)：是原核生物中核染色质以外的，能自主复制的双链环状DNA分子。 大小：1500-100kb 复制类型： 松弛型：质粒复制不受核染色体的控制，可以复制很多拷贝。 严紧型：质粒复制受核染色体的严格控制，复制的拷贝数量有限。 2．质粒载体：大多由小分子松弛型复制的质粒改造而成。 质粒载体构造： 复制起始位点：ori 多克隆位点:MCS 选择标记基因: pBR322 AmpR MCS ori pBR322 4363bp T-vector (五)病毒、噬菌体载体 1．噬菌体(phage)是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，如λ噬菌和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。 2． λ DNA: λ噬菌体中的基因组DNA。它能够进入其他生物体并在其他生物体内进行复制和表达。 大小：3-50kb 复制方式：整合复制或自我复制 噬菌体载体：由噬菌体DNA改造而成。 ①插入型。 ②置换型。 3．噬菌体载体结构特征： 柯斯位点(cos site)：2端2个12bp互补粘性末端。 大小：38-50kb 选择标记： (六)柯斯质粒载体 柯斯质粒由质粒和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成。 在包装时，cos位点打开而产生噬菌体λ的粘性末端。 所以可以说柯斯质粒是一类特殊的重组质粒。 三、基因工程常用方法 (一)聚合酶链式反应 1、定义：聚合酶链式反应(PCR)是根据生物体内DNA复制原理，利用目标DNA片段两侧的两个短的单链引物，在体外快速扩增特定DNA片段的技术。 聚合酶链式反应过程 生物体内DNA复制过程 ? 生