体外受精技术.pptVIP

1878年，Schenk(Germany)将体内成熟的家兔和豚鼠卵子与附睾精子放入子宫液中培养，观察到第二极体的排出和卵裂现象； 1945年，张明觉(华裔)偶然获得兔体外受精卵，但无重复性，且无试管动物出生； 1951，张明觉与Austin(澳)同时发现精子获能现象；1959年，他首次获得体外受精兔； 80年代以来，对胚胎需求量的加大，促进了家畜体外受精的研究，牛、绵羊、山羊、猪等体处胚相继获得了成功，国内90年代在家畜上也获得了成功； 现已将卵母细胞体外成熟--体外受精--早期胚体外发育--冷冻保存结合在一起，建立工厂化胚胎生产。 ⑵ 卵巢解剖法：卵巢切为两半，去掉中间的髓质部分，刀片划破卵泡，在培养液中反复冲洗 优点：能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回收率也相对较高； 缺点：回收的速度相对较慢，容易造成污染。 2. 活体采集(Ovum Pick-Up,OPU) ⑴ 腔镜法：腹壁切开一小口，插入腹腔镜，操作杆和穿刺针，配合将卵母细胞抽吸出来 优点：比较直观，容易掌握； 缺点：工作量大，对母牛有损伤，不能频繁手术。 ⑵ B型超声波法：超声波探头和采卵器插入到阴道子宫颈的一侧穹隆处。术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据B超屏幕上所显示的卵泡位置进行穿刺而将卵母细胞抽出 优点：不用手术，操作速度快，对母牛损伤小，可频繁采卵，且亦可对妊娠母牛采卵； 缺点：操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设备。 只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落（B级）(1层以上卵丘细胞）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟与胚胎发育的培养。A级：卵丘细胞致密，至少有5层以上；B级：卵丘细胞为2-4层；C级：卵母细胞大部分被包裹；D级：卵母细胞少量被包裹；E级：裸卵。 A、B级可用于培养，C、D级成熟率低。 （二）精子获能处理方法 1. 血清白蛋白法 将精子与血清白蛋白溶液进行长时间孵育 。 该法由于需要的时间较长，且诱发精子获能的作用不强，故仅在IVF技术研究的初期进行过尝试，具有一定作用，目前仅作为精子获能的一种辅助手段。 2. 高渗盐法 精子表面含有许多被膜蛋白，即所谓的“去能因子”。当用高离子强度溶液处理精子时，这些被膜蛋白将从精子的表面脱落，从而导致精子获能。 由于高离子强度溶液对精子具有渗透打击作用，会影响精子的活力，故目前已废除不用。 （二）精子获能处理方法 3.卵泡液孵育法 卵泡液含有来自血清的大分子物质，并含有诱发精子获能和顶体反应的因子，故在精液中添加一定浓度的卵泡液可诱发精子获能。 10%卵泡液，牛受精分裂率（40.3% Vs 87.5%）和囊胚发育率（8.3% Vs 40.4%）均显著下降，但加入50%的卵泡内膜细胞条件液则能 。 卵泡液可以用于精子的获能处理，但不能用于IVF系统。 （二）精子获能处理方法 4. 钙离子载体法 钙离子载体A23187能直接诱发Ca2+进入精子细胞内，提高细胞内的Ca2+浓度，从而导致获能。 0.5?mol/L~1.0?mol/L A23187溶液处理精子5 min，然后加入等量含1% BSA的BO溶液终止A23187的作用，即可将获能精子加到含卵母细胞的受精滴中进行IVF。 注意控制A23187的工作浓度和作用时间，否则会导致精子的活力下降和死亡。 （二）精子获能处理方法 5. 肝素法 肝素是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，与精子结合后，能引起Ca2+进入精子细胞内部而导致精子获能。 最初，制备好的精子常用含有肝素（100mg/L）的获能液预处理15 min，然后加到受精滴中进行IVF。 现直接将肝素（50mg/L）添加到受精液中进行受精。 （三）精子获能的检测 1. 精子形态及运动方式的观察 头部膨大，活力增强，超活化 2. 顶体反应的检测 （1）双重染色法 优点：无需昂贵设备，简单易行； 缺点：易发生误判 （2）透射电镜观察 成本高，制片繁琐，可操作性不强。 三、IVF培养系统 （一）微滴系统 20-40?l微滴受精液，覆石蜡油，每滴放入IVM的卵母细胞10-20枚及获能处理的精子（1.0-1.5）×106个/ml，孵育6 -24 h 优点：受精液及精液的用量均较少，IVF的效果亦较好； 缺点：结果易受石蜡油质量影响，操作繁琐，成本较高。 三、IVF培养系统 （二）四孔