生物物理学-2015年第10讲+细胞膜的生物物理学-02.pptVIP

Membrane Biophysics 02 Membrane Topology 膜蛋白的拓扑学 为什么要了解膜蛋白的拓扑学？ 蛋白质的结构决定功能 膜蛋白的功能具有跨膜方向性 了解膜蛋白的功能必须了解其膜拓扑学 什么是膜蛋白拓扑学？ (membrane protein topology) 1. 蛋白质序列中的跨膜片断 那些部位插膜 2. 蛋白质在膜上的取向 那些部分位于细胞膜的内侧，那些部分位于细胞膜的外侧 膜蛋白拓扑取向的基本原理 疏水性原则 脂双层的碳氢链区是高度疏水的区域 蛋白质的跨膜区域必定是高度疏水区域 蛋白质一般以?-螺旋形式跨膜 跨膜?-螺旋的长度一般为20个氨基酸 以20个氨基酸为单位，计算蛋白质序列的疏水性 蛋白质中疏水性大的序列，即为可能的跨膜区域 3.1 膜蛋白拓扑取向的基本原理 3.1.2 正电荷氨基酸向内原则 对大量已知结构的膜蛋白统计分析表明，荷正电的氨基酸倾向于位于膜的内侧 此规则只适用于长度小于60个氨基酸的片断 随片断长度的增加，正电荷氨基酸位于内侧的几率降低 疏水性的定量计算 ?Go0，表示氨基酸难从有机相转移至水相，即疏水 ?Go0，表示氨基酸易从有机相转移至水相，即亲水 ?Go用来代表氨基酸的疏水性 Xi为该物质在溶液中的摩尔分数 氨基酸的疏水性 疏水性氨基酸：Phe, Met, Ile, Leu, Val, Cys, Ala 亲水性氨基酸：Arg, Asp, Lys, Glu, Asn, Gln, His 膜蛋白拓扑学的研究方法 蛋白质疏水性分析 1. 以10-20个连续的氨基酸为计算单位，计算该肽段疏水指标之和（eg. 1-10, 2-11, 3-12, etc.）作为该肽段的疏水指数（hydropathy index） 2. 以疏水指数对氨基酸序号作图 3. 具有高的疏水指数的一个?20个氨基酸的肽段即为可能的跨膜螺旋片断 细菌视紫红质的结构 作业: 水通道蛋白，AQP1, 哪段是跨膜区域？ AA: 212-231 ？ AA: 120-139 ？ 膜蛋白拓扑学的研究方法 酶解法 蛋白质包埋在脂双层中可抵抗水解酶的作用 利用水解法可判断蛋白质暴露于膜外的部分 选择水解酶的作用方式可判断蛋白的取向 外侧加水解酶：蛋白向外部分发生水解 内侧加水解酶：蛋白向内部分发生水解 膜蛋白拓扑学的研究方法 酶解法 制备蛋白取向一致的膜囊泡 ? 加入蛋白水解酶（如胰蛋白酶） ? 加入酶抑制剂终止反应 ? SDS? 分析 酶解法 膜蛋白拓扑学的研究方法 酶解法 蛋白酶抑制剂必须有效 保证有限酶解，不是完全酶解 应用多种水解酶，互相印证结果 阴性结果说明 蛋白质没有膜外部分 或 膜外部分无水解酶切位点 检测方法： 如所研究蛋白占大部分，可直接分析 如所研究蛋白占少部分，须应用抗体或其它标记方法分析 膜蛋白拓扑学的研究方法 同位素标记法 制备蛋白取向一致的膜囊泡 ? 125I标记 ? SDS? 放射自显影分析 选择标记方式可判断蛋白的取向 外侧标记：蛋白向外部分被标记 内侧标记：蛋白向内部分被标记 膜蛋白拓扑学的研究方法 免疫学方法 制备蛋白取向一致的膜囊泡 ? 加入胶体金标记的针对特定肽段的单克隆抗体 ? 电子显微镜观察 ? 分析 膜蛋白拓扑学的研究方法 化学标识法 极性试剂 不能插膜：标记蛋白质膜外部分 非极性试剂 可以插膜：标记蛋白质膜内部分 将化学标识物事先用放射性同位素标记，反应后用放射自显影检测 膜蛋白拓扑学的研究方法 特殊部位定位法 糖基化位点：位于细胞膜的外侧 磷酸化位点：位于细胞质一侧 通过分析蛋白质上的这些位点即可推知相应修饰位点的拓扑取向 膜蛋白拓扑学的研究方法 融合蛋白法 原理： 特定蛋白质在特定的细胞器内方有活性 将待定蛋白基因与报告蛋白基因融合 将融合基因在适当宿主细胞中表达 测定报告蛋白的定位 优点：原位细胞器定位 缺点： 融合蛋白可能破坏原蛋白的拓扑取向 融合蛋白可能破坏原蛋白的构象及生化活性 * * * 2.2.1.2 化学势和溶质浓度的关系 假设溶液为理想溶液 混合焓变?H=0 混合熵变由简单统计规则给出 自由能变化为 另一方面 所以 式中 ??为纯物质的化学势，Xi为该物质在溶液中的摩尔分数 转移自由能与溶解度的关系 考虑烃类分子形成的相与水相两相共存 系统 烃类在有机相的化学势为 烃类在水相的化学势为 预测 实测 * *