三、基因工程的基本条件-基因载体.pptVIP

? genome(48502bp) ?噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。 3. ?DNA的复制 模型 （1） ?型复制 （2）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。 形成多联体?DAN分子。 这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。 （1）构建原理： 4. ?噬菌体载体的构建 （2）构建过程 ①用限制性内切酶去 ?DNA分子上的非必需区 ②在 ?DNA的非必需区内插入选择标记基因 ?噬菌体DNA上本身有5个 EcoR I 和7 个Hind III切点！ 删除?噬菌体的非必需区，留出插入空间。 ? DNA如质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。 在试管中与?噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。 必须利用噬菌体外壳的作用！ A 体外包装： ③建立?DNA分子体外包装系统 的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与? DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。 B 体外包装过程 ① ?噬菌体外壳蛋白的合成 E 基因 的E 基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的70%）。 D基因 E基因突变 只合成尾部蛋白和包装识别蛋白 D基因突变 合成头部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包装DNA 提取尾部蛋白和包装识别蛋白 提取头部和尾部蛋白 重组的?载体DNA 体外包装成活性噬菌体 （3）人工构建的?噬菌体载体有两种类型： ① 插入型载体（insertion vectors)： 只具有一个外源DNA插入限制酶位点，如 ?gt10、?gt11、?BV2、?NM540、?NM1590、?NM607 1）免疫功能失活型： 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。 EcoR I cI ?gt10 插入导致载体不能合成阻遏物，??载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 没有外源DNA插入的?载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。 选择标记: 如?NM1149载体的两个克隆位点（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因内部。 2）?-半乳糖苷酶失活型载体： 在?基因组中引入了LacZ序列。（其上含有一个EcoR I 克隆位点）。 感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。 LacZ EcoR I Charon16A 选择标记: ② 替换型载体（substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于?DNA的非必须区两端。 用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。 可置换区 MCS MCS 如： ? EMBL4、Charon40等。 ? EMBL4 ? EMBL4的可置换片断内部还有Sal I酶切位点。 以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。 左臂 可置换区 右臂 EcoR I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I Sal I Sal I ?EMBL4 ?载体克隆策略 置换型载体 比一般的质粒载体的容量大的多。 用在真核生物基因组文库的建立。 Sau3A BamHI 5. ?DNA载体的优点 1978年J. Collins和B. Hohn等人发展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid) ? DNA： 4—6kb （1）大小 （2）组成 cos序列和控制包装的的序列。 pBR322： 质粒的复制子 抗药性基因 几个限制性酶的单一位点 第四节 柯斯质粒载体 pHC79 ①具有?噬菌体的特性： （3）cosmid vector的特点 克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。 在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌 ）。 ②具有质粒载体的特性： 大多带有pMB1或ColE1的复制子，能像质粒一样复制。 有抗生素抗性基因，和插入失活的克隆位点。 ③方便的选择： ④高容量的克隆能力： 45kb （最少不能低于30kb）。 51kb-5kb=45kb （4）部分cosmid vector pJC720 pJC74m pJC75-58 pJC74 pHS262 pHC79 c2XB Cosmid 载体 克隆能力（kb) 克隆位点 选择标记 大小（kb) 复制子 11~28 HindIII, XmaI Elimm, Rifr 7.1 ColE1 16~32 BamHI Ampr, Kanr 21 ColE1 16~42 EcoRI, BamHI, BglII Ampr 11.4 ColE1 21~37 EcoRI, BamHI, BglII, SalI Ampr 15.8 ColE1 34~50 Ba