生物化学酶的催化机制.ppt

（2）三维结构的研究 酶的三维结构决定了酶的功能，如果得到酶的三维 结构信息，对酶的催化机制的研究提供最直接的线索 。获得酶三维结构的方法有X射线衍射和NMR。 （3）定点突变 分子生物学技术的发展使对蛋白质定点突变变的很 容易，所以只要得到一个酶的基因，就可以对其氨基 酸序列进行任意的突变。如果对一个酶氨基酸残基进 行有的放矢的突变，会对酶的作用机制研究提供有价 值的信息。把胰蛋白酶活性中心裂缝底部的Asp189突 变成不带电荷或带正电荷的氨基酸残基，胰蛋白酶活 性完全丧失。胰蛋白酶只水解碱性氨基酸残基与其他 氨基酸氨基形成肽键，所以Asp189通过侧链的负电荷 与底物上的碱性氨基酸残基带正电荷的侧链结合。 （4）动力学分析 动力学分析可以为研究酶的作用机制提供有用的数 据。 （5）化学修饰 用双功能试剂对酶的修饰有助于确定在三维结构上 相邻的基团。借助底物或竞争性抑制剂的保护，可以 通过化学修饰确定活性中心的氨基酸残基的性质。 例：假定一个酶分子上有6个Csy残基，但又无法确 定它的活性中心是否有或者有几个Csy残基，可以分 别在有或无过量底物存在下，用碘代乙酸修饰酶，然 后进行对比，在底物保护的情况下，不能被修饰的 Csy残基就在活性中心。 ΔG活为反应活化能HA-HB-HC为过渡态中间物。过渡态中间物既不是产物，也不是底物，而是介于旧化学键减弱，新化学键开始形成的一种不稳定的结构状态。活化能也不是反应的总自由能变，自由能变与反应平衡时底物浓度和产物浓度有关，而活化能与反应速度有关。活化能越低含有足够能量的反应物分子越多，反应发生的越快。提高温度或其他因素的作用可以促进更多的反应物达到过渡态，提高反应速度。所有的催化剂都是通过降低活化能加快反应速率。 酶促反应和非酶促反应过程的自由能变化 广义的酸碱催化和特定的酸碱催化的差别： （1）特定酸碱催化是H+或OH-加速反应，广 义的酸碱催化是酶分子上的酸性和碱性基团催 化反应。 （2）缓冲溶液对他们的影响不同。特定酸碱 催化反应速率只取决于pH，与缓冲溶液浓度无 关，广义的酸碱催化，缓冲溶液有助于通过提 供或夺取质子来稳定过渡态，反应速度取决于 底物和酶的质子化状态，还取决于缓冲溶液的 浓度。缓冲溶液浓度的升高提高了广义酸碱催 化的效率。 Y比X更好的离开基团，X是比Z更好进攻的基团，共价中间物的反应性比底物强。 所有蛋白酶在催化过程中都经历四面体的过渡态，该过渡态形成的原因是反应涉及一个亲核基团进攻肽键的羰基碳。如果是丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，进攻的亲核基团分别是Ser残基的羟基和Cys残基的巯基，否则就是水分子。丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的催化机理中包括共价催化，脂酰基酶是酶与底物的共价中间物，而金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶催化的反应更为直接，没有共价催化。 虽然各种丝氨酸蛋白酶具有高度的同源性，但构成催化三元体的三个氨基酸残基在肽链中的位置并不完全相同。然而，酶学家已达成共识，将这三个氨基酸残基总是进行一样的编号，即His57、Asp102和Ser195。它们在催化中的具体功能是：（1）Ser195充当进攻底物的亲核基团；（2）His57作为广义的酸碱催化剂；（3）Asp102 的功能仅仅是定向His57，影响His的 pKa，改变其酸碱性质。 糜蛋白酶的催化经历了酯酰化酶共价中间物，全部反应分五步： 1、底物和活性中心的Ser195和Gly（甘）193 残基通过氢键形成ES复合物，疏水口袋正好能 容纳芳香环。 2、亲核的Ser195残基进攻羰基碳，形成第一 个四面体的过渡态中间物。 活性中心的三个氨基酸残基依次参与此阶段 的反应 3、四面体中间物因肽氧负离子与Ser195以及Gly193之间形成氢键而稳定。 4、肽键断裂，离开基团从His57咪唑环上得到一个质子。原来肽键羧基一侧通过氢键以及与Ser195形成共价键仍与酶结合。 5、水进入活性中心，质子化His57，使之成为酸。释放出来的OH-亲核进攻留下来的多肽羰基碳，第二个四面体形的过渡态中间物形成。最后Ser195从His57重新获得质子，His仍然与它通过氢键相连，过渡态中间物瓦解，酯酰化酶中间物被水解。 天冬氨酸蛋白酶 活性中心涉及两个重要的Asp残基，他们交替充当广义的酸碱催化剂。多数天冬氨酸蛋白酶都具有由两叶（N端和C端各成一叶，每一叶相当一个结构域）组成的三级结构，两叶呈两重对称。属于这一蛋白酶家族的有胃蛋白酶，肾素、组织蛋白酶等。在中性或偏酸条件下活性最高，与丝氨酸蛋白酶一样，在功能上要么是消化酶，要么是调节酶。其催化机制为： 1、水和多肽底物进入两重对称的活性中心。 2、两个Asp残基的羧基具有不同的pKa。