基因操作和其医学应用.pptVIP

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What is the Gene? 基因(gene) 是核酸链上贮存遗传信息的遗传单位,是贮存有功能的蛋白质多肽信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。 What is the Genome? 基因组(genome) 指细胞或生物中,一套完整单倍体遗传物质的总和,包括全套基因及间隔序列。 人类基因组包含22条常染色体和XY两条性染色体(核基因组)以及线粒体上的遗传物质(线粒体基因组)。 原核基因组和真核基因组 真核生物基因组远远大于原核生物的基因组,结构复杂,基因数庞大,具有许多复制起始点,每个复制子大小不一 人类染色体单倍体DNA全长3×109bp,含3~4万个基因。 大肠杆菌DNA全长4.6?106bp,含4000个基因。 原核基因组 Prokaryote Genome 基因重组 基因操作的关键步骤和核心内容 关系到研究的成败或质量 包括:基因分离,基因组合,基因转化,基因筛选 目的基因片段与载体的连接 质粒的分类 克隆载体(cloning vector,Puc18,19)都有松弛的复制子,能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。带有一些基本元件(ori,Ampr,Mcs等),用来克隆和扩增基因片段。 表达载体(Expression vector,PET30a,pMV361)除了有克隆载体的基本元件,还具有转录/翻译所必需的DNA顺序。为了有效的转录,必需有强大的启动子(Trp,Lac)。 筛: 外源基因表达 克隆基因在原核细胞中表达 克隆基因在哺乳动物细胞中表达 克隆基因在其它表达系统中表达 昆虫表达系统 酵母表达系统 真核表达体系(酵母、昆虫、哺乳动物细胞) 优点:能转录后加工,即能剪接内含子;能翻译后加工,即能糖基化修饰等;通常不形成包涵体,能正确折叠。 缺点:但技术难度较大,成本较高,表达量较低。 基因治疗的基本类型 ★细胞介导的基因治疗(ex Vivo) ★体外表达基因治疗 (in Vitro) 是传统的基因表达形式。 在原核表达体系(以Ecoli为代表): 优点 1.遗传背景清楚,易于调控; 2.表达技术经典成熟,应用广泛,目前无以取代; 3.目的基因表达水平高, E.coli培养周期短,“物美价廉”. 缺点 1. 缺少真核蛋白质翻译后加工修饰系统,如剪切,糖基化,及正确二硫键形成等; 2. 表达蛋白质多以包涵体形式存在,需经复性才能恢复构象与活性; 3. 宿主本身杂蛋白质多,纯化步骤复杂,故某些蛋白质,特别时糖蛋白或脂蛋白, 酌情选择真核表达载体。 转基因和基因治疗 转基因和基因治疗 1.概念和研究现状 2.基因治疗的基本类型 3.转基因的基本方法 4. 转基因的表达和调控 5.基因治疗的运用和前景 内 容 提 纲 基因治疗是以正常基因替代或置换靶细胞染色质基因组中的致病基因从而产生新表型的治疗方法。 转基因技术则是将目的基因导入靶细胞以建立治疗效应的方法和过程。 转基因及基因治疗 基 本 概 念 转基因及基因治疗 基因治疗的程序 目的基因 转基因 基因表达 基因治疗 viral nonviral In vivo ex vivo 体内调控 是当前较常用的形式。是选用适当的靶细胞载体外进行基因转移,筛选阳性细胞重新移植入体内。可用原代或细胞系进行。但靶细胞存活较短暂(Transit)。 1、病毒法(Viral) 1)逆转录病毒(Restrovirus) RNA病毒,结构缺陷 Packaging Cell 转基因及基因治疗 转基因的基本方法 ★ 体内直接转基因治疗(in Vivo) 转基因及基因治疗 基因治疗的基本类型 是最有前途的方式。已在肝、气管、肌肉、乳腺、腹腔动、静脉初获成功。效果持久。但转移和表达效率低。 优势: ① 整合率高; ② 对外源DNA影响小; ③ 单拷贝整合,利于表达调控; ④ 安全。 转基因及基因治疗 转基因的基本方法 劣势: ① 容量小; ② 只能感染分裂活跃细胞,体外(Exvivo)转基因; ③ Transite expression; ④ R.V.+P.C+P.C 实验室要求高。 转基因及基因治疗 转基因的基本方法 2) 腺病毒(Adenovirus) 腺相关病毒(Adenoassociated virus) DNA病毒    E1和E3基因缺乏  263细胞系生长 转基因及基因治疗 转基因的基本方法 特点: ① 能感染静止细胞,体内(in vivo)转基因 ② 对某些细胞类型特别亲和力,利于局部基因治疗

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