基因工程基础操作和程序.pptVIP

* * 基因工程的基本操作程序 基因工程基本操作的四个步骤： 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 基因的结构（补充知识） 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 ①RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。 ②转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 ③转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。 1、编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。 2、非编码区 ：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。 (原核细胞) (真核细胞) 编码区 非编码区 非编码区 内含子 外显子 启动子 终止子 基因的结构（补充知识） 与RNA聚合酶结合位点 1、编码区 2、非编码区 ：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 一、目的基因的获取 1、目的基因的来源 2、获取目的基因的常用方法 ①从自然界已有的物种分离 ②人工方法合成 ①从基因文库中直接获取 ②如果需要大量的目的基因，需要对目的基因进行PCR技术扩增 （一）从基因文库中直接获取 按照外源DNA片段的来源： 从特定组织提取的染色体基因组DNA ---基因组DNA文库（总） mRNA反转录成的cDNA拷贝----cDNA文库（部分） ②基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 ①基因文库的分类 限制酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 1)基因组文库 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。 目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 1.基因文库 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库 2)cDNA文库 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 2.基因文库的构建方法 ①直接分离法 (鸟枪法) 多用于原核生物 ②人工合成法（真核生物） 逆转录法 化学合成法 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________. ②原理：__________ ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成倍地扩增 (二)利用PCR技术扩增目的基因 （二）利用PCR扩增目的基因 1、过程 高温变性（解旋为单链） 低温退火（引物与单链互补结合） 适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链） 重复循环 1、过程 （二）利用PCR扩增目的基因 （二）利用PCR扩增目的基因 2、条件 已知基因的核苷酸序列、 四种脱氧核苷酸、 引物 TaqDNA聚合酶 使目的基因的片段在短时间内成倍地扩增 4、结果 耐高温 3、方式：以指数方式扩增，即____（n为扩增循环的次数） 2n 适宜的温度和PH值 思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 复制原点 目的基因 启动子 终止子 标记基因等 1、基因表达载体的组成 基因表达载体的构建—— 核心 1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 2、构建过程 基因表达载体的构建——核心 质粒 DNA分子 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上