青霉菌的原生质体制备技术研究薛康平任富亮邢建广王越甲摘要.doc

青霉菌的原生质体制备技术研究 薛康平 任富亮 邢建广 王越甲 摘要：实验证明青霉菌原生质体形成最佳条件是用马铃薯液体培养基，液体震荡培养温度28℃, 培养42h，蜗牛酶的浓度为5mg/ml，酶解3.5h ，酶解温度33 关键词：青霉菌 原生质体 蜗牛酶 1 原生质体简介 细胞壁被酶水解剥离，剩下有原生质膜包围着的原生质部分称为原生质体Weibull 等于1953年首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞获得原生质体。其形状随不同菌类而异，革兰氏阴性菌经酶水解后细胞壁尚有残余部分，细胞具刚性，保持球形，称为原生质球或球质体；革兰氏阳性菌细胞壁去除彻底，失去刚性，原生质体类似于球体。不论原生质体或原生质球都基本保持原细胞结构，活性和功能，只是因为它们去掉了细胞壁，对渗透压特别敏感。 原生质体诱变是一种行之有效的育种新技术，它是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。Kim等于1983年首先采用该法诱变玫瑰色小单孢菌（Micromonospora rosaria）取得成功以来，应用逐渐广泛，已在抗生素，酶制剂，有机酸及维生素等高产突变株的选育中起到重要的作用。 丝状真菌原生质体的提取方法有三种：机械法，非酶分离法和酶法。采用前二种方法制备的原生质体效果差，活性低，仅适用于一些特定菌株，因此并未得到推广。在实际工作中，最有效和最常用的是酶法，该法时间短，效果好。到目前为止，适合于原生质体分离的各种酶类已经得到开发和应用。 酶法分离原生质体的方法：首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶震荡法培养，取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下（温度，pH值等）酶解细胞壁[7]。酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经G-2和G-3砂芯漏斗过滤，除去大部分菌丝碎片。滤液进一步低速离心10min,洗涤后弃去上清液，沉淀悬浮于同一种高渗溶液中，即可得到纯化的原生质体。酶法分离原生质体的本质是以微生物细胞壁为底物的酶水解反应，作为底物的细胞壁，其组成与结构又与培养基成分，培养条件，菌齢和预处理等因素有关。 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 菌株 青霉菌，来自河北科技大学（生物科学与工程学院微生物实验室保藏菌株） 2.1.2 培养基 马铃薯低渗培养基 马铃薯等渗培养基（即含0.7mol/l NaCl的上述培养基） 2.1.3 试剂 蜗牛酶，石炭酸复红染色液，蔗糖，KH2PO4.7H2O，MgSO4，酵母膏， NaCl。 2.1.4 仪器与设备 （1）IA-1003电子天平,TGL-16C台式离心机，光学显微镜，超净台，恒温箱，电磁炉，4℃ （2）移液枪及枪头，1.5ml离心管，小医用注射瓶，100ml量筒，锥形瓶，培养皿，烧杯，镊子，酒精棉球，绳子，接种针，封口膜，报纸。 2.2 方法 2.2.1配制马铃薯低渗培养基 （1）称取土豆434.97g，切成小块，放入锅中煮。用纱布过滤除去土豆泥，得到土豆汁500ml。 （2）称取2g蔗糖，0.5g KH2PO4.7H2O、0.5g MgSO4、1.5g酵母膏放入烧杯中，从原土豆汁中取出160ml一并放入烧杯，再加水至500ml。 （3）取100ml于锥形瓶中，加入2g琼脂，其余的分装入3个锥形瓶。 （4）做好标记，与培养皿一起放入高压锅中灭菌。 （5）灭完菌后，固体培养基倒平板，液体培养基放入4℃冰箱 2.2.2配制马铃薯等渗培养基 （1）称取0.4g蔗糖，0.1g KH2PO4.7H2O、0.1g MgSO4、0.3g酵母膏放入烧杯中，从原土豆汁中取出32ml一并放入烧杯，再加0.7mol/l的Nacl至100ml。 （2）称取2g琼脂放入烧杯中。 （3）混匀后分装入5个锥形瓶。 （4）做好标记，与培养皿一起放入高压锅中灭菌。 2.2.3 配制不同浓度的蜗牛酶液 (1)称取20mg蜗牛酶于小医用注射瓶中，并加水至2ml，此即为浓度10mg/ml的蜗牛酶液。 (2)从上述酶液中分别取80、240、400、560、720于小医用注射瓶中，并补水至800ul。 (3)此即为浓度分别为1、3、5、7、9mg/ml的蜗牛酶，用记号笔做上标签。 2.2.4 配制0.7mol/l Nacl溶液 称取32.76gNacl固体溶于无菌水中，定容至800ml，灭菌并4℃ 2.2.4 将保存在冰箱中的青霉菌接种在新配制的马铃薯固体培养基中。28℃恒温箱中培养2-3d 2.2.5 (1) 接种：培养好后，从平板培养基中，取一环菌接种于马铃薯液体培养基中，33。C恒温摇床分别培养36h、42h、48h。 (2)离心：将培养好的青霉菌在12000