毛细管电泳等电聚焦.ppt

CIEF of a fusion protein with SH 4-8 CIEF of hemoglobin AFSC with different pH range CAs SH pH 4-8 SH pH 5.5-7 CIEF of fusion protein with different pH range CAs ?AES公司自主研发的pI标记物，数量多达29种，pI 范围 2.8-10.5 小分子pI标记物，pI 标示准确、稳定性好 每 0.5?pH单位有一对Marker, 有足够的Marker和样品峰尽量靠近，保证pI 校正的重 复性和准确性。 2.85 10.45 3.21 3.5 3.59 7.05 7.0 6.61 6.14 5.85 5.91 5.12 4.65 4.22 4.5 4.14 7.55 8.18 7.65 8.4 8.71 8.79 9.33 9.46 9.77 10.1 7.4 pI 标记物 CEInfinite 的优势 宽范围覆盖的 pI 标记物 报告内容 全柱成像 cIEF 技术作为一种创新的等电聚焦方法，可以应用于蛋白质或其他两性物质等电点的测定，等电点的测定可精确至0.01个pH单位。 在生物制药厂的实验室里，全柱成像 cIEF 可应用于药物研发、细胞株筛选、生产过程分析、药物制剂研究分析、药物稳定性研究以及最终产品的质量控制分析。 单克隆抗体 重组蛋白 疫苗 等电点测定及异质性表征： CEInfinite: 抗体药物表征的利器 根据蛋白质电荷特性的差异可区分鉴别蛋白，因此通过测定蛋白质的等电点，可以部分地确定蛋白质的属性。通过对所分离的不同蛋白变异株的定量，可评估其异质性。 某单克隆抗体的全柱成像cIEF结果 IEF条件： 蛋白浓度：0.4mg/ml CA：4% HR pH 3-10 电场：600V/min Urea：4mol/L 聚焦时间：5 min Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 Peak 5 Peak 6 Peak 7 7.14 7.27 7.37 7.48 7.54 7.62 7.79 7.14 7.26 7.37 7.47 7.54 7.62 7.79 蛋白质 pI 测定 在生产和纯化过程中，蛋白质能表现出多种电荷异质性改变，这些变化不仅影响药物的稳定性，也影响活性，而且还可能导致有害的免疫反应。所以，开发和生产过程中蛋白药物的电荷异异构体的分析非常关键。 Charged Isomer pI (n=2) 1 6.27 2 6.33 3 6.41 4 6.48 5 6.56 6 6.64 7 6.73 蛋白质药物和抗体药物的电荷异质性表征 药物差异化表征 3 种不同的 IgG：人源与鼠源差异明显 HSA: 厂家 1 HSA: 厂家 2 HSA: 厂家 3 国内 3 厂家的人血清白蛋白 HSA 细胞株筛选 标准对照 细胞株 1 细胞株 2 细胞株 3 细胞株 4 细胞株 5 蛋白质药物的稳定性研究 Temperature pI-1 pI-2 pI-3 pI-4 25oC 8.28 8.10 7.97 8.42 40oC 8.28 8.09 7.95 8.40 60oC 8.28 8.10 7.96 8.40 在 25℃、40℃、65℃ 三个Incubation 温度条件下，目标蛋白质构象保持稳定，四个电荷异构体的CIEF-WCID 电泳图没有明显差异； 在25℃、40℃、65℃ 三个Incubation 温度条件下，四个电荷异构体的pI值完全一致，说明在65oC的高温下，蛋白质没有变性，其构象稳定。 每个温度下的样品重复二次分析，其重复性出色，pI 值测定的RSD1%。 25oC 40oC 65oC 1 2 3 4 将 Incubation 温度持续提高到 75℃， 研究发现其 CIEF-WCID的电泳图发生显著改变（与25-65℃），意味着蛋白质发生明显变性，其构象完全改变， 75℃为其构象改变的临界温度； 在75℃的温度下，与25-65℃相比，四个主要电荷异构体的峰消失，形成一个 “宽包”峰 （pI 范围 7.4-8.3），整体 pI 点向酸性位移； 在75℃的温度下，整体 pI 点向酸性位移，意味着蛋白质变性，更多的酸性功能基团暴露。 65oC 75oC 定量分析 Main Peak Others pI Area% Area% of acid peaks Area% of basic peaks 9.08 58.8 36 5.2 mAb Peak NO. Peak1 Peak2 Peak3 Peak4 Peak5 Peak6 Peak7 Peak8 Peak9