核酸分离纯化.ppt

第五章 核酸的分离纯化 核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础； 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。 　DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象。 DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。 核酸分离纯化的原则 　　一、 保持核酸一级结构的完整性 　　二 、尽可能提高核酸制品的纯度 提取DNA总的原则 1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。 第五章 核酸的分离纯化 第一节 核酸分离纯化的设计及原则 （一） 材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有不同的要求 需考虑制备核酸所需的时间与成本 应选择安全的试剂与制备方案 （一）核酸的释放 DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。 表５-１ 各种组织细胞破碎方法 核酸分子抽提的技术设计 核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应 用最广泛的方法） 核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液 应该清除的杂质主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子 时，其它的核酸分子皆为杂质 3、加入的有机溶剂和某些金属离子 （三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀是浓缩核酸的最常用的方法 常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁 常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除 ⑴ 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收 紫外线，其最大吸收波长为260nm。 ⑵　荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌 入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激 发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与 溶液中核酸的含量呈正比。 ⑴ 紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与 降低均提示不纯。 在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8 纯RNA的A260/A280比值为2.0 浓度鉴定 紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度 A260×稀释倍数×50＝ μg/ml 紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。 ⑵荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电 泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多，电泳迁移率低。 荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng） ⑴ 琼脂糖凝胶电泳法： 　 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可 判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段 的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果 发生降解，电泳图呈拖尾状。 完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。 一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。 1、短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。 2、长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。 2、RNA的储存 RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70℃ 保存。如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液 中加入RNasin或