基于抗原表位分析的妊娠相关血浆蛋白A的克隆表达及其临床诊断应用研究-临床医学；临床检验诊断学专业论文.docx

天津医科大学博士学位论文中文摘 天津医科大学博士学位论文 中文摘要中又捅要 目的： 针对妊娠相关血浆蛋白A(PAPP—A)CDS区的特定抗原表位，利用重组克 隆技术，制备PAPP．A重组蛋白，利用这种抗原蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体， 在此基础上制备酶标记抗体以及生物素化抗体。建立一种针对PAPP-A的高灵敏 度酶联免疫检测(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法，制备相关 的试剂盒，在临床上应用于产前筛查唐氏综合征(Down syndrome，DS)和急性 冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)，指导相关疾病的诊治。 方法： 1．借助于DNAstar软件，分析PAPP—A的CDS区，选择抗原性最强的一段 抗原表位编码区。 2．从新鲜胎盘组织中提取总RNA，反转录并PCR生成PAPP—A编码区的 DNA；另一方法是购买PAPP—A一质粒转化菌种制备DNA。 3．PAPP—A的DNA*IJpET42a质粒分别双酶切，凝胶回收之后连接，转化Topl0 大肠杆菌，筛选阳性克隆鉴定正确后，转化BL21大肠杆菌，诱导产生PAPP—A 重组蛋白。利用镍柱纯化。 4．制备的重组蛋白注射家兔，制备抗PAPP．A抗体。并用金黄色葡萄球菌蛋 白A(SPA)亲和层析法纯化PAPP．A抗体。 5．抗原的纯化。足月孕妇血清依次用免疫亲和层析法，离子交换法以及分子 筛法纯化。 6．用辣根过氧化物酶(HRP)和生物素(Biotin)标记PAPP．A抗体并且优 化反应条件。 7．将以上的方法进行灵敏性、重复性、稳定性等的方法学评价。 8．用灵敏以及超敏感试剂盒检测相关DS、ACS标本。 争士田三日禾： 1．利用DNAstar软件，结合对PAPP．A序列信号肽位置的预测，疏水性、二 级结构，结果表明碱基序列1-309 bp带有信号肽，这一区段表达的重组蛋白能 够自由进出细胞膜，易于分泌到血液中。 天津医科大学博+学位论文2．本研究购进转化入细菌的PAPP．A基因质粒，结果成功从扩大培养的细菌 天津医科大学博+学位论文 2．本研究购进转化入细菌的PAPP．A基因质粒，结果成功从扩大培养的细菌 中得到DNA。 3．按照常规的制备重组蛋白的方法，成功制备PAPP．A重组蛋白。 4．利用制备的PAPP．A重组蛋白注射新西兰家兔2只，得到PAPP．A抗体， 利用琼脂双向凝胶扩散测定效价，达到1：16。 5．将抗体连接在凝胶上，装在柱子中，制成免疫层析柱。 6．酶标抗体的制备采用过碘酸钠法。得到的即为标记酶。测定酶的量：1．2 mg／mL，生物素化也成功制备。 7．足月孕妇血清经过亲和层析，离子交换以及分子筛层析之后，在SDS．PAGE 检测的条带中呈现较为单一的条带，效果良好。 8．检测不同孕期孕妇是否有DS。BA．ELISA方法的建立在检测第一二孕期 是否有DS患儿有较大的临床价值。我们制备了高灵敏的检测ACS患者的 BA—ELISA试剂盒同样发现有较大临床应用价值。 结论： 本研究有针对性的制备PAPP．A重组蛋白，可以避免了其他抗原表位的干扰， 使得抗原蛋白特异性增强，并且重组蛋白能够较为容易得到。通过注射家兔制备 了相应的抗体，经过一系列层析之后，可以用于连接生物素以及辣根过氧化物酶。 成功制备BA—ELISA检测体系。 本研究灵敏度等方法学评价指标均良好。成功用于检测不同孕期的胎儿状况 检测，并且可以用于检钡JJACS患者。BA—ELISA方法提供了临床上快速、准确、 方便检测PAPP．A的工具，使得PAPP．A的检测的临床应用价值较大。 关键词：妊娠相关血浆蛋白A克隆表达生物素亲和素BA—ELISA唐 氏综合征急性冠状动脉综合征 天津医科大!!；乏博+学位论文Abstract 天津医科大!!；乏博+学位论文 Abstract Ob j ect i ve：We prepared recombinant pregnancy—associated plasma protein A (PAPP—A)based on the analysis of epitopes of the CDS region and the protein was inj ected into two rabbits to make PAPP—A polyclonal antibody,then we prepared HRP and biotin labeled antibody．Then the BA—ELISA kit was made to detect PAPP—A concentrations in serum of patients of DS or ACS，the aim was to det