gc190092专家意见回复.doc

一、第一审稿人初审意见： 赵加玲等作者尝试利用大肠杆菌系统诱导表达结核分枝杆菌来源的Rv2742。结核分枝杆菌1998年就已经完成全基因组的测序工作，但是到目前为止，大部分结核分枝杆菌的基因注释还是未知，对分枝杆菌基础研究阻碍了防痨的研发。此工作研究有一定的现实意义。 但是本工作需要考虑以下问题： 1 对于工作意义，作者需要解释为什么需要研究Rv2742，其蛋白的生化特征？临床上的意义？ 答：我们在前言中补充了Rv2742基因研究的意义。传统的基因组注释是利用已知的基因特征和同源性比较实现的，难于发现人类未知的、新基因结构特征的基因，造成这些生物学功能和菌株鉴别可能重要基因的遗漏，逃离人类研究的视线，形成盲区。Rv2742新基因是我们基于蛋白质基因组学发现的新编码基因之一，经NCBI-BLASTP后，数据库中没有比对到相似序列，属于功能未知蛋白。经过T细胞表位预测（ /），Rv2742新蛋白的高可信的T细胞表位数有19个（0.5分），高可信T细胞表位覆盖到该蛋白的66.42%的序列，与已知表位库比较，都是新型的表位。我们推测，该蛋白具有很好的免疫原性，旨在为解决结核病原分子检测及免疫学诊断临床实践中遇到的特异性和灵敏度不高等底层难题提供原始创新性成果。本研究中Rv2742新型基因的克隆、表达及纯化体系的建立为其进一步免疫原性及其潜在功能研究提供了较好的基础。 2作者只是尝试利用更换载体和改变基因的编码策略，但是实验证明并不是成功。具体地说，在诱导表达中，作者尝试了4种载包括pGEX-4T-2、pET-32a、pET-28a、或pMAL-c2X，pET32a, pET28a基本属于同类的载体，如果尝试融合表达体系是否考虑更多选择-例如与分子伴侣共表达？还有作者只利用一种工程菌株BL21 (DE3)进行检测, 目前公司已经研发了多种表达菌株，建议利用减少编码策略的菌株进行表达。还有，诱导表达，需要考虑的是培养条件，作者只是采用了一种条件，IPTG 1mM, 28℃, 6h。是否应该考虑低温结合低IPTG诱导方法。还有，Tuberculist中Rv2742是存在与细胞膜部分，如果没有Tween20等去污剂增溶而不能有效的分离。作者没有列出裂解液配方，但是洗脱液和Wash Buffer中没有去污剂成分。另外，对结核分枝杆菌的纯化，目前还可以考虑用耻垢分枝系统纯化。建议作者可以系统的优化每个步骤，以获得预期的目标表达和纯化获得Rv2724蛋白。 答：谢谢您的建议。宿主的选择中pET-32a和pET-28a虽然属于同属pET载体，但二者的标签大小不一样，而标签的大小尤其对小蛋白的表达有一定程度的影响，所以在实验过程中考虑到使用不同种类和大小标签的pET载体。 在修回文稿中，我们比较了五种不同宿主、不同诱导温度及不同IPTG浓度，对Rv2742蛋白表达量的影响。我们将pMAL-c2X-Rv2742（密码子优化后）重组质粒分别转化至宿主表达菌株JM109(DE3)、BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS及Transetta（DE3）中，1 mmol/L IPTG，28 ℃诱导6-8 h。10% SDS胶比较诱导前后目的蛋白的表达量。由于Rv2742是新基因，目前结核数据库中（UniProt、NCBI、TubercuList）均没有记录，尚不知道其在细胞中的定位信息（尽管数据库中已注释基因Rv2742c的细胞定位是在质膜上），此部分实验正在开展中，我们根据其在结核染色体中的位置及结核命名规则将其命名为Rv2742。考虑到后续纯化条件，我们选择的细胞裂解液成分是PBS+1 mmol/L PMSF+ 0.5%Triton x-100；清洗液成分是20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF、0.5%Tritonx-100；洗脱液成分是20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、10 mmol/L MBP、1 mmol/L PMSF、 0.5%Tritonx-100。不同宿主诱导表达比较发现，目的蛋白Rv2742虽在其它四个宿主中实现了可溶性诱导表达，但在Transetta(DE3)宿主中的表达量尤为显著（图1A）。 Transetta(DE3)是携带氯霉素抗性质粒BL21的衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子（AUA、AGG、AGA、 CUA、 CCC、 GGA）对应的tRNA，提高外源基因在该系统中的表达水平，为我们其它结核遗漏注释基因的表达、纯化提供了较好的宿主选择性。 其次，我们基于Transet