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第三章 细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第二节 细胞组分的分析方法 ? 细胞组分：细胞器、生物大分子（蛋白、核酸） 细胞组分的分离技术（细胞外） 细胞组分的显示方法（定性、定位）（细胞内） 细胞组分的定量技术 生物大分子的合成、运输（动态研究） 1、细胞组分的分离技术 ?离心：分离细胞器与生物大分子及其复合物 ?差速离心：分离密度不同的细胞组分 ？ ?密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离 ?电泳：生物大分子 核酸电泳照片 2、 细胞组分的显示方法 原理：利用一些显色剂与所检测结构或物质中一些特殊基团特异性结合、反应的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色深浅来判断某种结构或物质在细胞中的分布和含量。 例：中性红活染高尔基体、詹纳斯绿活染线粒体 显示DNA的 Feulgen（孚尔根） Staining 2、细胞内大分子的显示方法 核酸： Schiff试剂 DNA（Feulgen反应）紫红色 甲基绿-焦宁 RNA红色 DNA 兰绿色 多糖：高碘酸-席夫反应 脂肪：锇酸 黑色（苏丹Ⅲ 橘黄色） 蛋白质：米伦反应等。 （1）、 特异蛋白的定位与定性 免疫化学：抗原抗体反应 免疫荧光技术：异硫氰酸荧光素、罗丹明 免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术、 免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等（可用于动态研究） （2）、 细胞内特异核酸的定位与定性 原位杂交技术 光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针）（P68表3-3） 电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） PCR技术 3、定量细胞化学分析技术 ? 细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）：利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 仪器：细胞分光光度计 ? 流式细胞仪（Flow Cytometry）： 流式细胞仪的应用 定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。 4、生物大分子的合成 同位素标记、荧光标记技术 例：用3H 标记T，DNA的半保留复制； 用3H 标记核仁，rRNA的合成场所 同位素放射自显影示例 第三节 细胞培养、细胞工程技术 ?细胞的培养 ?细胞工程 一、细胞的培养 ?动物细胞培养 ?植物细胞培养 ? 非细胞体系（cell-free system） 1. 细胞培养相关概念 原代培养（原代细胞）（primary culture cell）：从直接取自生物体的细胞、组织、器官开始的培养。 继代培养（继代细胞）（sub-culture cell）：将细胞从一个培养瓶转移至另一个培养瓶培养。 细胞株（cell strain） 正常二倍体 细胞系（cell line） 克隆：从一个细胞通过有丝分裂发展起来的一群细胞的聚合体。 2. 动物细胞培养 贴壁培养：形成致密的单层细胞 悬浮培养：大规模培养 3. 植物细胞培养 ?类型： 单倍体细胞培养（花粉培养） 原生质体培养 （体细胞培养） 4. 非细胞体系（cell-free system) 定义：不具有完整的细胞结构，但包含进行正常生物学反应所需物质的体系。 例：不具核膜的真核细胞 二、细胞工程 ?细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 ?细胞拆合与显微操作技术 1. 细胞融合 方法：电融合（物理） 聚乙二醇（化学） 仙台病毒（生物学） 单克隆抗体（monoclone antibody） ：1975年，英国科学家Milstein和Kohler发明。 2. 细胞拆合与显微操作技术 细胞拆合：把细胞的核与质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相融合形成核质杂交细胞。 可用于研究核质互作机制。 显微操作技术：示例转基因小鼠 生物学研究模式生物 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 细胞实验安排 3-11周 各班分两个组，选出组长 星期二 5-8节 星期四 6-9节 由代老师和周毓老师指导 实验目录见文档，