牛病毒性腹泻病毒p80蛋白表达.PDF

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　２０１６（０７上）：１－４，２７３ 牛病毒性腹泻病毒ｐ８０蛋白的表达 及其单克隆抗体的制备 杨立新，朱远茂，周跃辉，任建乐，马　磊，杨　婷，薛　飞 （中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／大动物 传染病研究室，哈尔滨 １５０００１） 中图分类号：Ｓ８５２．６５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４－７０３４（２０１６）０７－０００１－０５ 关键词：牛病毒性腹泻病毒；ＲＴ－ＰＣＲ；ｐ８０蛋白；免疫印迹试验；单克隆抗体；ＩｇＭ；间接免疫荧光试验 摘　要：为了制备牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）ｐ８０蛋白单克隆抗体，试验采用ＢＶＤＶ接种牛肾细胞 （ＭＤＢＫ），提取病毒ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出ＢＶＤＶ的ｐ８０基因，将其定向克隆到原核表达载体 ｐＥＴ３０ａ，得到重组表达质粒ｐＥＴ３０ａ－ｐ８０。将重组质粒转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）表达菌，挑选单菌 落并扩大培养，经ＩＰＴＧ诱导和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ以及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析表明重组蛋白ｐ８０获得了表达， 分子质量约为４４ｋｕ。同时用浓缩的ＢＶＤＶ培养液免疫６～８周龄的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，取免疫鼠脾细胞与 ＳＰ２／０细胞进行融合。利用纯化的重组蛋白ｐ８０作为检测抗原的间接ＥＬＩＳＡ筛选阳性杂交瘤细胞， 经过３次亚克隆后对获得的杂交瘤细胞进行间接免疫荧光（ＩＦＡ）和抗体亚类鉴定及腹水的制备和效 价的测定。结果表明：重组ｐ８０蛋白具有很好的反应性；获得８株稳定分泌针对ＢＶＤＶｐ８０蛋白的杂 交瘤细胞株，分别为３Ｅ３、２Ａ４、８Ｈ９、３Ｇ３、２Ｂ３、３Ｇ２、２Ｇ２和４Ａ１１；８株杂交瘤细胞株接种 Ｂａｌｂ／ｃ小鼠 ５ ７ 制备腹水，采用ＢＶＤＶ作为包被原的间接ＥＬＩＳＡ方法测得其效价为１×１０～１×１０；８株杂交瘤细胞 所分泌的ＭＡｂ具有良好的反应性和特异性；８株单克隆抗体的抗体亚类均为ＩｇＭ／。说明制备的重 κ 组ｐ８０蛋白单克隆抗体可试用于建立检测ＢＶＤＶ抗原的诊断方法。 　　牛病毒性腹泻病毒（Ｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ， ＢＶＤＶ。目前，ＢＶＤＶ呈世界性分布，给养牛业造成巨 ＢＶＤＶ）是养牛业的一个非常重要的病原，可引起牛 ［４］ 大的经济损失 。 病毒性腹泻／黏膜病（ＢＶＤ／ＭＤ）。感染 ＢＶＤＶ的牛 ［５］ ＢＶＤＶ属于黄病毒科瘟病毒属的成员 。根据 临床症状表现为精神沉郁，采食量下降，大量流涎，产 ＢＶＤＶ５′非编码区（５′ＵＴＲ）的不同可以分为ＢＶＤＶ－ 奶量下降甚至停奶，腹泻，结膜炎，口腔黏膜充血、溃 ［５］ １型和ＢＶＤＶ－２型两个基因型 。不同基因型又包 疡，孕牛可能流产或产出畸形胎儿，新生犊牛经常发 含不同的亚型。根据接种细胞后能否产生病变， ［１］ ［２］ 生致死性腹泻 。该病毒是由Ｐ．Ｏｌａｆｓｏｎ 于 １９４６ ＢＶＤＶ分为致细胞病变型（ＣＰ）和非致细胞病变型 ［３］ 年首次在美国东部地区分离。我国李佑民等 于 （ＮＣＰ）。若怀孕母牛感染 ＮＣＰ型ＢＶＤＶ后，会导致 １９８０年从进口怀孕母牛的流产胎儿中首次分离到 胎儿免疫耐受，胎儿或继续发育或流产，即使顺利产