定序图试验结果2s100-清华大学生命科学院.ppt

Summer Research 清華大學 生命科學系04級 孫敏瑜 891645 Introduction 2002年暑假我來到位於高雄的國立中山大學-卓忠隆老師的分子生物實驗室。卓老師讓我跟著他的得意門生-陳錦苡學長做一些簡單的分生實驗，以練習基本技術為主。錦苡學長的研究主題是:利用抑制性扣減雜交(Suppressor Subtractive hybridization，SSH)找出調控大鼠腦幹死亡過程的基因。 學長利用SSH建構了相關基因的cDNA library。而我所要做的就是將這些gene cloned，確定insert是正接或反接，然後送定序，可供後續研究用。 我總共cloned了兩個gene: GMF-β及s100。 原料:網狀腹外側核（rostral ventrolateral medulla（RVLM ))cDNA 實驗過程 (1)以RVLM的cDNA ，加入欲clone gene的primer(fr)， 再加入Taq polymerase ，run PCR。 (2)Run electrophoresis，check?有產物。 (3)使用kit來purify PCR product。 (4)以分光光度計來測量DNA的濃度及純度。 (5)Run electrophoresis，與marker對照確定是我要的DNA片段。 (6)將這些純化的產物保存在-200C 冰箱。 實驗過程 (7)接下來要準備transformation了， 所以我要自己製作agar plate(with amp w/o amp) 還有自己製作competent cell (來源: e.coli JM-109) 。 (8)?? Ligation: 將純化的PCR產物與本實驗所用的pGEM T easy vector進行ligation 。 (9)Transformation (10)從plate上挑菌 (藍白篩選法)挑白色菌，種到含有LB medium的試管中，培養16-20hr。 (11)隔日，抽plasmid ，以EcoR I切3hr，再以electrophoresis確定是否有成功insert。 實驗過程 (12)成功insert的那幾管菌，再重新培養到新的試管中。 (13)以kit 抽plasmid ，此時抽出的plasmid較純， 送定序check是正接or反接。 (14)本來想利用insert上的restriction enzyme切位與vector上的切位，使用適當的restriction enzyme來切， 可判斷是正接或反接。但上網查了一下GMF-B及s100上的切位，發現所需要的enzyme實驗室沒有。所以還是送定序來確定是正接或反接(因為兩者的序列可在網上查到) 。 實驗流程 實驗結果 1. GMF-β (1)?? PCR產物由電泳圖來看量還算夠 實驗結果 (2)?? Transformation效率不高， 可能是我做的competent cell效率不夠強， 或是ligation效果不夠好 。 (3)?? restriction enzyme切割結果: 實驗結果 大部分都有成功insert ， 我從這些成功的insert中挑了四管，再純化plasmid 。 (4)送定序 (5)定序結果:四個recombined plasmid都是正接的 定序圖 實驗結果 2. s100 (1)?? PCR產物由電泳圖來看量還算夠 實驗結果 (2)Transformation效率不高， 可能是我做的competent cell效率不夠強， 或是ligation效果不夠好。 (3)restriction enzyme切割結果: 實驗結果 相當奇怪!!切出的片段有的不一樣長，只好將plasmid再做一次PCR ，確定有insert到正確片段(學長教的) 。 實驗結果 由圖看no.3是錯的， no.1有兩條band也怪怪的，所以只有2.4.5.6比較有可能成功。學長說no.1的情形可能是最初PCR時，溫度沒有設好，所以primer不專一的接到別的片段，所以純化時也連這些片段一起純化。 ligation後產生兩種recombined DNA ，使transformation後有兩種菌產生:含有S100 及另一種insert的菌。為了確定，我又重挑了四管菌:no9-12 。 實驗結果 抽plasmid切割後，與之前的no.2切割片段及plasmid PCR產物比較，發現竟然不一樣長…可見果然有insert到錯誤的DNA片段 實驗結果 因為後來純化plasmid的kit沒了， 而且暑假也結束了， 所以來不及將s100送定序 --交給