构建表达载体实验流程和注意事项.pptVIP

* 热激转化 手持冰盒到-80 ℃ 冰箱前，取出感受态管，插入冰中。 手指捏感受态管底2-4sec使其融化后，加入连接产物，枪尖温和搅匀，于冰上30min。 42℃水浴90sec（一定要准确，不要时间过长）。 冰浴２min后，加入800μL的LB在37 ℃振荡30～45min。 取200μL涂布于含Amp(50μg/mL)等相应抗生素的 平板， 37℃培养过夜，观察结果 将150mL锥形瓶中放入5～10mL培养基，加入抗生素，挑取菌斑，250转/min振荡培养过夜。（摇菌前可先做菌液PCR） 提取质粒，电泳，酶切 * 重组质粒筛选 1、抗生素筛选法 2、互补法 蓝白斑筛选： PUC系列载体含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。 DH5α含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。 3、PCR、酶切 * 质粒提取：碱裂解法 收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。 溶液Ⅰ： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖 溶液Ⅱ： NaOH, SDS 冰上3-5min，时间过长会： 质粒断裂；羟基化影响酶切 溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸