血清碱性磷酸酶活性测定第一组.pptVIP

血清碱性磷酸酶活性测定;酶活力测定与酶法分析;影响酶促反应速度的因素包括底物浓度、酶浓度、ph值、温度、激活剂、抑制剂等。 酶活力单位指：在特定条件下1分钟能将1微摩尔底物转化为底物所需酶量，或转化底物中1微摩尔的有关基团的酶数。 酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶活力单位数。 方法： 1.终止测定法（定时法或终点法） 2.动力学分析法（连续监测法或速率法） 3.物质含量的测定方法 ;酶法分析 ！指应用酶作为工具定量测定某种物质含量的分析方法。 （一）单酶反应定量法 1、直接测定底物的含量 2、由辅酶变化量测定底物量 （二）偶联酶反应定量法 E1 E2 A B C ;酶活力测定和酶法分析在医学上的应用;实验目的; 实验原理 在PH10 环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。测定红色物质的吸光度就可以计算酶活性的大小。 反应式如下：磷酸苯二钠+H2O——苯酚+磷酸氢二钠 苯酚+4-氨基安替比林——红色醌亚胺衍生物 ;实验器材和试剂： （一）器材：5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴 （二）试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 称取无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮沸，称取磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结晶水，则应称取2.54g)加入煮沸的蒸馏水中使其溶解，冷却后用煮过的冷蒸馏水加至500ml，再加氯仿2ml，置冰箱保存，此为底物溶液。 3．铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1 000ml，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。 4．酚标准工作液（0. 05mg/ml）：购买合格的二级标准品。 ;实验操作;;立即混匀。用510nm波长比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。 计算 ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白???*0.05*100(金氏单位）;临床意义 在临床上，血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。 1．血清ALP活性升高 ： 肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。 2．血清ALP活性降低： 比较少见，主要见于呆小病，ALP过少症，维生素C缺乏症。;注意事项 1．底物溶液中不应含有游离酚，如有酚则空白管显红色，说明磷酸苯二钠已经开始分解，应弃去不用。 2．铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定显色作用。该液应避光保存，如出现蓝绿色即应废弃。 3．加入铁氰化钾溶液后必须立即混匀，否则显色不完全。 4．黄疸血清及溶血血清应分别作对照管，一般血清标本可以共用对照管 ;标准曲线法 制备如下： 取试管6支，分别加酚标准液(1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟，各管加入1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(??次为0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标准曲线。