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人尿中exosomes的分离和免疫电镜鉴定 李艳艳1 张渊1 代义1 邱峰2 秦霞2 邱宗荫1* （1重庆医科大学药学院，重庆 400016 2重庆医科大学附属第一医院，重庆 400016） 摘要 目的：分离人尿液来源的exosomes，并通过免疫电镜对其进行鉴定。方法：本研究以超速离心法分离健康志愿者混合尿液中的exosomes，运用1D SDS对其蛋白质组进行分离，并通过免疫电镜对exosomes进行鉴定。结果：超速离心法分离得到的exosomes含有丰富的蛋白信息；人尿液来源的exosomes小体为脂质双分子层的扁平或球形小体，直径主要在 30nm-100nm之间。结论：通过超速离心结合免疫电镜的方法，成功地从人尿液中对exosomes进行分离和鉴定，为从exosomes中寻找与疾病相关的潜在生物标志物奠定了基础。 关键词：尿液；exosomes；免疫电镜；1D SDS 1 引言 Exosomes又称外来体或外泌体，是细胞的多囊泡体(multive—sicularbody，MVB)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的单层膜包裹的小囊泡，1987年由Johnstone[1]等第一次在网织红细胞多囊泡体的胞外细胞质融合时发现。Exosomes是一种直径为30nm～100 nm的小囊泡，内含蛋白质、脂质以及微RNA等多种成分。不同细胞来源的exosomes所含的蛋白质不同，其生物学功能也有所不同[2]。许多细胞均能分泌exosomes，由肿瘤细胞分泌的exosomes具有瘤抗原性，可通过吸附、交联、捕捉等方法固定于树突状细胞(dendritic cell，DC)表面，提呈给细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，介导免疫反应，抵御恶性肿瘤，可用于肿瘤的免疫治疗[3]。树突状细胞（DC）来源的exosomes（DEXs）和肿瘤细胞来源的exosomes（TEXs）因为具有抗肿瘤的作用，是目前研究的热点。其中，DEXs 临床试验正在进行中[4]。 尿液中的exosomes是一种低密度的固相成分，其蛋白含量占正常人尿液总蛋白的3％左右[5]，被认为携带有丰富的生物标志物信息，因此近年来受到普遍关注[6]。 Trairak Pisitkun等以纳喷LC-MS/MS的方法分析尿exosomes蛋白质组，发现了与肾脏疾病和血压调节有关的21种蛋白质，他们认为尿中exosomes是一种发现疾病标志物的良好生物标本[7]。Hua Zhou等研究报道在肾脏损伤等疾病发病过程中，exosomes含有大量的生物标记物[8]。然而，成功的分离纯度较高的exosomes是进行相关研究的基础，本实验对人尿液的来源的exosomes进行分离提取，并通过免疫电镜从超微结构水平对其进行观察和鉴定。 作者简介：李艳艳，女，重庆医科大学在读硕士研究生，电话E-mail：liyanyan912@ 邱宗荫：*通讯作者，重庆医科大学教授。电话：023E-mail： zongyin141@126.com 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 单板夹芯式垂直电泳槽，电脑三恒多用电泳仪电源（北京六一仪器厂）；L8-70M 超高速离心机（美国贝克曼公司）；PHLIPS-TECNAI 10电子显微镜（荷兰飞利浦）；超纯水装置（重庆利迪公司）；高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；超高速离心机（日本日立公司） 叠氮化钠（美国Sigma公司）；甘油、三乙醇胺、 40%(w/v) 丙烯酰胺/甲叉双丙稀酰胺(37.5:1)溶液、十二硫酸烷基钠、过硫酸铵、考马斯亮蓝R-250(上海生工);四甲基乙二胺(美国Bio-Rad公司)；蛋白Marker、亮抑酶肽、苯甲基磺酸氟（美国BBI公司）；分析纯乙醇、醋酸、甲醇、异丙醇、过碘酸钠（重庆川东化工厂）；胰蛋白酶溶液（测序级胰蛋白酶稀释在0.025mol/L的碳酸氢铵溶液中，浓度为12.5ng/μl）;Bradford蛋白质定量试剂盒（上海生工公司）；兔抗人AQP-2抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；5nm胶体金标记的羊抗兔IgG二抗（武汉博士德公司）； 2.2 样品的收集、贮存和处理 2.2.1 尿样的来源 10例健康志愿者(5男5女，来自重庆医科大学，年龄24-28岁，无全身性系统性疾病，近2周无用药，无吸烟史，女性不在月经周期内)的混合尿样。 2.2.2 尿样的采集 分别于清晨采集健康志愿者第一次中段尿约200ml，等量混合，立即加cocktail蛋白酶抑制剂