叶俏血浆循环DNA在原发性干燥综合征和系统性红斑狼疮中的意义.pptVIP

血浆循环DNA在原发性干燥综合征和系统性红斑狼疮中的意义 嘉兴市第二医院 风湿免疫科 叶俏 背景 血浆循环DNA，它具有DNA双螺旋结构，与基因组的DNA核苷酸及碱基组成上基本一致，能代表生物学特性，在肿瘤上研究很多，在免疫性疾病中报道不多，尤其在干燥综合症中报道甚少。 测定pSS、SLE血浆cDNA浓度值，旨在探讨cDNA在pSS及SLE中的意义。 对象和方法 pSS患者 36例均符合2002年干燥综合征国际分类标准 SLE患者（排除继发干燥综合征患者）共29例，诊断符合美国风湿病学会（ACR）1982推荐的SLE分类标准 健康体检者30例 排除感染、肝炎、结核、创伤、应激、严重的心血管及脑血管疾病急性期等可致cDNA升高的因素。 主要试剂和仪器 微量样品DNA提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司） LightCycler 480(Roche Diagnostics)实时定量仪 日立7060/70C70型生化仪（日本）。 观察指标 血浆cDNA 血沉（ESR)，C-反应蛋白（CRP），免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM) SLEDAI，SSDAI，SSDDI 标本采集 取静脉血5ml置于EDTA抗凝管中 ，离心完全去除血细胞成分置干燥洁净冻存管中， -70°C低温冰箱保存备检，统一检测 。 血清DNA的扩增 PCR扩增管家基因GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶） genbank：NM_001256799.1 引物序列：Primer Forward：5-CTGGGCTACACTGAGCACC-3，Primer Reverse：5-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3 ，PCR产物长度186dp 血清DNA的扩增 扩增反应采用三步法PCR扩增标准程序：50 循环数， 第一步-预变性：95℃ 30秒 ，第二步-PCR反应：（50个循环） 95℃ 5秒， 55℃ 30秒，72℃ 30秒 。 标准品的制备 利用正常人血浆提取质粒，并检测质粒OD（吸光度）值，通过所得OD值计算核酸质量，利用跨内含子的基因GADPH的引物扩增样品，测得样品血清中核酸的具体含量，并对质粒进行10倍的梯度稀释，得到浓度相差10倍的一系列标准品备用 标准品的制备 利用各标准品扩增所得CT值与相应标准品浓度，得到样品模板量计算公式为：X=（Y-28.69235）/-3.62966（Y：Ct值，X：模板量），根据这个公式计算标本循环DNA含量 统计学处理 采用SPSS18.0 软件对资料进行统计学分析，定性资料的比较采用χ2检验，定量资料表示, 各组间比较采用单因素方差分析，相关分析定量资料采用Pearson相关分析；等级资料采用Spearman相关分析，P0.05表示差异有统计学意义 。 结 果 0 100 200 300 400 500 600 700 800 SS SLE NORMAL 3组血浆循环DNA统计所得结果柱状图见图（纵坐标单位为ng/ml） 各组间cDNA值比较 组别 浓度值 pSS组(n=36) 368.24±196.68ab SLE组(n=29) 244.51±164.10b 对照组（n=30） 24.56±16.76 注：3组两两比较：与SLE组比较aP0.05;与对照组比较bP0.05 表1 3组循环DNA浓度值(ng/ml)比较 pSS组各指标间的相关性分析 cDNA SSDAI SSDDI ESR CRP IgA IgG IgM 浓度值 0.551** 0.198 -0.089 -0.252 -0.246 0.333* -0.086 (0.01) (0.248) (0.605) (0.137) (0.148) (0.047) (0.617) 表2 循环DNA浓度值与SSDAI,SSDDI等指标的相关性分析(r, n=36) 注：表内为相关系数r, 括号内为P值, *P0.05, **P0.01。 pSS组cDNA与SSDAI相关性分析 pSS组cDNA与IgG相关性分析 SLE组各指标间的相关性分析 cDNA浓度值与SLEDAI、ESR、CRP、免疫球蛋白等指标无相关性 . 讨 论 循环DNA，又称为游离DNA，正常人血浆／血清中存在微量游离DNA，来源于各条染色体的片段数与该染色体的大小有关 ，片段中内含子、外显子、插入序列的比例与全基因组构成比相似，因此循环DNA与疾病密切相关。 Suzuki N，Kamataki A，Yamaki J，el a1．Characterization of circulating DNA in healthy human plasma[J]．Clin Chim Acta，2008，38