破骨细胞培养及鉴定.pptxVIP

破骨细胞培养与鉴定; 破骨细胞(Osteoclast)是骨组织中的多核巨细胞，位于骨组织表面的浅凹处。目前一般认为破骨细胞来源于骨骼外的造血系统，其前体可能属造血干细胞的前单核细胞，由于破骨细胞是一种终末细胞，不能增殖和传代，只能进行原代培养，且存活时间较短，故分离细胞培养法难以获得大量的破骨细胞，不易满足研究的需要。 ;体外获得破骨细胞的方法： 一、机械分离骨组织中的成熟破骨细胞 二、骨髓单核细胞诱导分化培养 三、血液单核细胞诱导分化培养 四、脾干细胞诱导培养法 ;(一)成熟破骨细胞分离培养法;1．主要实验材料 (1)细胞来源 新生大鼠或兔，妊娠6个月以内的引产胎儿等。 (2)细胞支持物 薄骨片，盖玻片。 (3)培养液 M199培养基、MEM或DMEM培养基均可，加10％－15％胎牛血清。 ;2．培养方法 (1)薄骨片的制备 取新鲜牛股骨干的密度骨部分，沿骨纵轴用骨锯切割成大小约0.5cm×0.5cm、厚为0.1cm的小块，再用金刚砂轮磨成厚约10-50μm(以便在相差显微镜下观察)的薄骨片。使用前超声洗涤3次，每次约10min。然后依次浸泡在3个盛有含青霉素(1000U／m1)、链霉素(1000μg／m1)、两性霉素B(3μg／m1)的抗生素溶液的小容器中，每次10-20min。最后可浸在盛有含抗生素的培养液的容器内，置4℃(短期)或-20℃(较长期)冰箱内保存备用。 ; (2)破骨细胞的分离和培养 所有取材、分离与培养过程须在无菌条件下进行。 ①取出生后3-5d的大鼠，拉颈处死后置于盛有75％酒精的容器中，消毒3-5min后取出放入培养皿中。 ②用手术剪剪开其四肢皮肤、肌肉，取股骨和胫骨等长骨，放入盛缓冲液的培养皿中。除去骨表面的软组织、骨膜以及软骨。 ; ③将除去骨膜等多余组织后的长骨干部分清洗后，置于盛有少量培养液的培养皿中。用手术刀或手术剪纵行剖开骨干。用手术刀轻刮骨的内表面，同时用尖吸管不断吸取培养皿中的培养液，冲洗骨内表面多次，直至骨内表面变白为止。 ④用吸管吸打上述含碎骨片及分离细胞的培养液2－5min，使附着于碎骨片上的破骨细胞分离脱落于培养液中。静置1－2min后，待碎骨片沉降，收集细胞悬液。 ; ⑤将细胞悬液加入到预置有薄骨片或盖玻片的24孔培养板中，在37℃、5％C02培养箱中培养。 ⑥培养30～60min左右，取出薄骨片或盖玻片用培养液冲洗以除去未附着的骨髓造血细胞。冲洗后，将薄骨片或盖玻片移入另一培养板中继续培养。 ;3．培养结果 培养30min，破骨细胞即已贴壁，胞质逐渐伸展；培养2h后，细胞铺展，形态不规则，有伪足，细胞内可见多个细胞核；培养10h后，即可见薄骨片上出现小的凹陷；24h后凹陷明显增大。 ;(二)骨髓单核细胞诱导分化培养;1．主要实验材料 (1)实验动物 大鼠、兔、人等。 (2)培养液 M199培养基、RPMI 1640培养基或MEM培养基，配制时须加20％的小牛血清、HEPES 25mmol/L，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子100ng／m1。 (3)淋巴细胞分离液 密度为1.077g／m1。 ;2．培养方法 (1)薄骨片的制备 同成熟破骨细胞分离细胞培养法中的薄骨片制备。 (2)骨髓单核细胞分离及培养 所有取材、分离细胞及培养过程均须在无菌条件下进行。 ; ①动物的处理和长骨取材同成熟破骨细胞分离细胞培养法步骤①、②。 ②用手术剪纵行剖开长骨骨干，用尖吸管取培养液冲洗骨髓腔。将含骨髓的培养液缓慢加入有淋巴细胞分离液的离心管内，1000r／min下离心10min。 ③用吸管吸取中间乳白色细胞层。用培养液洗2次，分别以1000r／min离心10min，弃上清液。 ; ④加入培养液，制成细胞密度为5×105个／ml的悬液。将细胞悬液接种到预先置有薄骨片或盖玻片的24孔培养板中。 ⑤将培养板置于37℃、C02培养箱中培养。培养5d后换液。换液时，轻轻晃动培养板，再吸去培养液，这样可除去末贴壁的细胞，然后加入新鲜的培养液继续培养。以后每周换液1次。培养时间为3-4周。 ;3．培养结果 培养l周以后，可有多核细胞形成。随培养时间延长，此类细胞数量逐渐增多。 ; 用淋巴细胞分离液进行离心分离，所获得的中间乳白色细胞层包含全部的白细胞成分。在吸取这层细胞时动作要准确、轻柔，以防混入其他层细胞(尤其是骨髓内结缔组织细胞) 。 ;（三）血液单核细胞诱导分化培养;1．主要实验材料 ⑴实验动物 成年SPF级纯种雄性SD大鼠1只。 ⑵主