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细胞爬片实验方案
准备：盖玻片、4%多聚甲醇、50%的甘油PBS
4%多聚甲醛溶液:
多聚甲酵40g O.lmol/L磷酸缓冲液 至1000 mL
方法:称収40g多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500-800 mL 0.1 mol/L
磷酸缓冲液,加热持续搜拌(或磁力搅拌)使粉末完令溶解,通常需滴加少许NaOH才能使溶液清亮,最后补足0.1 mol/L的PBS至1000 mL,充分混匀。
0.1 M (pH 7.4) PBS
1 mol/L Na2HP04
77.4ml
1 mol/L NaH2P04
22.6ml
蒸馏水
加至1000
1爬片的准备
爬片可用一般的盖玻片也可用专用爬片,根据自己的需要剪裁成合适的大小,以备置于6孔板、12孔板或24孔板;将剪裁好的爬片,泡酸过夜,捞出后流水洗净,烤干浸泡于75%酒精中备用
2细胞爬片
用胰酶消化好细胞,充分吹打,使之成细胞悬液,计数,根据需要调整细胞到适当密度。取无菌的细胞培养板,先加少量培养基(以使玻片与培养板紧密接触)。将玻片小心从洒精中取出,在酒精灯火焰外焰轻轻划过,使玻片表面酒精燃烧从而起到灭菌的效果。待冷却后,将玻片轻轻放入培养板中,然后将单细胞悬液一逐滴的滴到上而。然后置于37°C 5%C02的细胞培养箱屮培养。培养一定时间后培养液换为含材料的培养液继续共培养（2ml, 100μg ml-1 in DMEM）6h后，用PBS冲洗两遍去除未被吞噬的纳米颗粒，然后取出爬片。对于贴壁能力较弱的细胞,爬片前应将玻片置于细胞培养板中,用PLL包被至少Ih。
3细胞固定
爬片置于37°C PBS中洗三次,每次10到20秒钟,然后在4%多聚甲醛中室温固定15分钟,然后再用37°C PBS将多聚甲醛冲干净,清洗过程要注意手法轻柔, 否则细胞会从玻片上脱落。固定后的细胞爬片置于滤纸上晾干,然后用50%的甘油PBS溶液封片,备用。
4共聚焦显微镜
激发690nm, 荧光在400nm左右
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