基因工程的诞生和发展.pptVIP

基因工程的诞生和发展 1. 基因工程的工具 （1）基因操作的车间——大肠杆菌和病毒 （2）获得基因片段的工具——限制性内切核酸酶 （3）连接基因片段的工具——连接酶 （4）基因操作的载体——质粒和病毒 2. 重组DNA实验 基因工程的内容 1. 基因操作原理 （1）DNA和RNA的操作 核酸的分离、纯化、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基本技术 （2）基因克隆 构建基因组文库或cDNA文库 2. 基因工程的应用 （1）生物反应器：生产生物活性物质 （2）遗传改良：转基因植物、动物 （3）基因治疗（gene therapy） 将健康基因移植到相关组织或细胞使患者的症状减缓或消失 基因工程胰岛素（一） 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知 基因工程胰岛素（二） 将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%! 基因工程干扰素（一） 干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。 基因工程干扰素( 二) 基因工程人干扰素α-2b（安达芬） 是我国第一个全国产化基因工程人干扰素α-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。 其它基因工程药物 人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。 基因诊断与基因治疗 运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦。 SCID的基因工程治疗 重症联合免疫缺陷（SCID）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称ADA）的基因（ada）发生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。 基因治疗SCID的过程 §4.1 基因工程工具酶 一、限制性内切核酸酶（一）限制与修饰 1. 限制与修饰现象 早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity）。 ??噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表 2-1）。?? 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 E.coliB含有 EcoB 核酸酶和 EcoB 甲基化酶 λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。 细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。 R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。 2. 限制酶的发现 20 世纪 60 年代，人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次从 E.coli K 中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上。 1970 年，美国约翰·霍布金斯大学的 H. Smith 于偶然中发现，流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，从而找到 HindⅡ 限制性内切酶。 HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如下： 5 … GTPy ↓ PuAC … 3 ? 3 … CAPu ↑ PyTG … 5 从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。 EcoRⅠ是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下： ????????????5 G↓AATTC 3??????