共聚焦显微镜.pptVIP

尼罗红(Nile red):是一个理想的脂肪染色剂,它只在疏水环境中显示很强的荧光.除了在所需显示的脂质中被溶解外,尼罗红与组织不发生任何反应. 利用相应的特异荧光控针标记后 观察单个细胞不同部位或不同组织区域接受刺激后的整个变化过程 (一)实时定量测定细胞内Ca2+的变化 (二)测定细胞内PH变化 (三) 检测膜电位的变化 (四)检测细胞内活性氧物种的产生 (五)检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位 (六)检测荧光共振能量转移(FRET) (七)检测荧光漂白恢复(FRAP) 基本原理: a其乙酰羟甲基酯(AM)形式是Fluo-3AM,无荧光,为不带电荷的亲脂性化合物,易于渗透脂膜进入活细胞内 b在胞内被非特异酯酶水解,释放出游离酸形式的荧光探针分子,此游离态也无荧光,不易漏出胞外 c一旦与Ca2+结合后便形成复合物,并有较强的荧光产生,从而发挥其钙探针的作用. KCL诱导的细胞外Ca++内流测量 培养/分离的细胞 ? 20?M Fluo 3-AM负载液30-60min ? 清洗、换液 ? 扫描 KCL 若须快速测量 1.改变扫描速度 2.采用双向扫描 3.减少采样点数(牺牲空间分辨率） 4.采用线扫描(xt) KCL 常用的荧光探针有BCECF和6-COFDA BCECF的激发光谱是PH依赖性的 比例法:即分别用490nm和440nm光激发BCECF所得到的发射