实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳.pptVIP

实验三血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳PolyAcrylamide Gel Electrophoresis(PAGE);一、实验目的;蛋白质的分离;电泳技术;迁移率 电场力 F=EQ （E：电场强度， Q：电荷) 阻力 F=6πγηυ （γ：半径，η：介质粘度） υ/E表示单位电场强度时粒子运动的速度，称为迁移率 ，也称位泳动度，以μ表示： μ= υ/E=Q/πγη 可见，离子的迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质， 即其所带的电荷和形状。不同的粒子有不同的迁移率，因此 电泳一定时间就可分开它们。 ; 样品性质 与分离样品所带电荷成正比，与样品相对分子质量成反比。 电场强度 电压越高，带点粒子移动越快。 缓冲液的性质 缓冲液的PH值距等电点越远指点所带静电荷越多，迁移速度越快；反之越慢。离子强度等于1/2∑cizi2 支持介质 理想电泳支持介质应是网状结构、不带电荷、对被分离物质无吸附作用的惰性材料。 温度 ;电泳的分类;二、实验原理;2.概念; 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。 根据有无浓缩效应可分为：连续系统与不连续系统，其中不连续系统因具有浓缩效应，分离条带清晰度及分辨率较佳应用更为广泛，本次试验应用的为不连续系统。 ;;聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点：;表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。 可多个样品的电泳 胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高。 胶版薄而透明，可制成干板，便于长期保存与扫描。 可进行双向电泳。血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只可以分离出5~6条区带，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分离出数十条区带。;3.基本原理; 1.样品胶：PH为6.7 　2.浓缩胶：是大孔胶，PH为6.7的TRIS-HC1（省略）　3.分离胶；是小孔胶，PH为8.9　4.电极缓冲液：是PH为9.0的硼酸-硼砂缓冲液;分离机制;（2）电荷效应：在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质分子的???电点不同，在同一pH的分离胶中所带有效电荷不同，因而迁移率也就不同。根据电泳的基本原理，带电荷越多，运动速率就越快，经过一段时间的电泳分离，各种蛋白质就按泳动速率快慢顺序排列成一个一个圆盘状的蛋白质区带。;（3）分子筛效应：由于分离胶的孔径较小，各种蛋白质分子由于分子大小和构象不同，因而通过一定孔径的分离胶时所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同。分子小，受阻滞小的走在前面；而分子大，受阻滞大的走在后边，这样就使大小、形状不同的蛋白质样品得以分离。即使蛋白质所带的净电荷相似，也会由于分子筛效应被分开。;凝胶过滤层析中的分子筛效应;三、主要试剂与仪器：;试剂编号;实验操作 凝胶柱的准备 ;四、操作步骤：;（2）立柱：取8×0.5 cm的玻璃管，一端用封口膜封好，垂直插入橡皮垫子中，并将之稳定于架子上。 （3）灌胶：用胶头滴管吸取配置好的分离胶溶液，插入玻璃管底部，沿管壁缓缓注入胶液至离上端约1cm处。如有气泡，可轻轻叩打玻管，排除气泡。管的下方不要漏胶。 注意：灌胶完毕后立即清洗胶头滴管和小烧杯。 ;（4）水封：立即用胶头滴管沿凝胶管内壁在已加的胶液上边加入约3~5mm高的蒸馏水。须缓慢进行，防止胶液面被破坏或水层与胶层的混合。 （5）静置：40min，使其充分聚胶。胶柱上端有一明显折光界面，表示凝胶已完成。 （6）去水层：聚胶后，用注射器小心吸去胶液上的水层，并用滤纸将残存的水分吸干。注意不要破坏胶面的完整性。;2．样品液的制备：取血清 0.05ml，加入样品稀释液0.95 mL，内含溴酚蓝作为示踪染料，混匀备用。;3．电泳 装柱-加液-加样-封液-电泳 （1）装柱：选择合适的凝胶管，去掉下端的封口膜，垂直插入上层电泳槽的橡胶塞孔中，留有适当的高度（要使凝胶表面露出橡皮塞），若有没插满的孔要用实心的橡皮塞堵塞。每个孔都要塞紧，防止漏液。 ;装 柱 将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡(上电极槽以电极和凝胶管完全浸入为宜，下电极槽以凝胶管浸入3/5为宜);（2）加液：向下电泳槽加入适量的硼酸-硼砂缓冲溶液，没过凝胶管的底部和电极，注意胶柱下方不要有气泡。 （3）加样：用胶头滴管吸取配好的样品液，沿管壁缓慢加在凝胶柱上边，加样量以凝胶管内样品液高度2~3mm为宜。加样枪不可插入过深，以免刺破凝胶，同时要缓慢、均匀，以免搅动缓冲液引起样品扩散。 （4）封液：用胶头