提RNA+逆转录+qRTPCR步骤.docVIP

【一、提RNA】 一、实验准备： 1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、 2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20℃冰箱预冷； 3、预冷离心机(1.5mL EP管用的)； 4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩； 二、操作步骤： 01、弃上清（不回收，直接倒去）； 02、1mL/孔 PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200μL枪吸尽PBS）； 03、每孔加500μL Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右； 04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口EP管； 05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol)； 06、4℃离心机，12000g，15min； 07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中（注意：只能吸到上清）； 08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)； 09、4℃离心机，12000g，10min； 10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀； 11、4℃离心机，7500g，5min； 12、倒掉上清，加入1mL预冷的75%乙醇，混匀； 13、4℃离心机，7500g，5min； 14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠； 15、每管中加入40μL(40