标本的采集保存与运送.docVIP

核酸扩增荧光定量法检测 SARS病毒实验手册 卫生部医药生物工程技术研究中心 中山大学达安基因股份有限公司 二零零三年五月 目 录 一、标本的采集、保存与运送 二、荧光定量PCR法检测SARS病毒标本前处理 三、FQ-PCR实验曲线基本参数含义以及结果分析标准程序 四、FQ-PCR检测SARS病毒报告发放标准程序 五、达安SARS病毒检测试剂的质检标准操作程序 六、FQ-PCR检测SARS病毒室内质量控制标准操作程序 附录1 SARS病毒核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书 SARS病毒核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书（for Lightcycler） 附录2 各种荧光检测仪的使用和校准 1、ABI PRISM 7000型核酸扩增荧光检测仪 2、LightCycler型核酸扩增荧光检测仪 3、Gene Amp 5700型核酸扩增荧光检测仪 4、低温离心机 附录3 实验室生物安全防护及消毒 附录4 广东省卫生厅关于临床试用非典病毒基因荧光PCR技术的通知 标本的采集、保存与运送 漱口液 取无菌生理盐水5ml盛装在15ml标准带盖密封一次性无菌塑料离心管内，采样时为提高病毒检出率，选择发病早期（最好5天以内）的病例，并且应在病人进食2小时后采集标本，期间尽量少喝水，采样时可让患者先咳嗽数声，然后用5ml无菌生理盐水漱口，漱口时让患者头部后仰，发出噢声，让采样液在咽喉部转动3～5秒，随后通过纸漏斗缓缓吐回离心管中。 标本应带冰（预先准备冰壶）在2小时内尽快送至实验室。标本至实验室后，应尽快进行处理及检测，如在24小时内可安排检测，标本可置4℃保存。如未能安排检测，则放－20℃保存，需要长期保存应置－70℃。 粪 便 使用清洁便盆盛装患者粪便，用灭菌竹签挑取含脓、血或粘液的粪便置于15ml标准带盖密封一次性无菌塑料离心管内。 标本应带冰（预先准备冰壶）在2小时内尽快送至实验室。标本至实验室后，应尽快进行处理及检测，如在24小时内可安排检测，标本可置4℃保存。如未能安排检测，则放－20℃保存，需要长期保存应置－70℃。 荧光定量PCR法检测SARS病毒标本前处理 漱口液 a）穿戴好隔离服等防护设备，启动全排Ⅱ级生物安全柜（以下简称生物安全柜）。待生物安全柜正常工作后，双手戴上第二层手套，从冰箱取出标本，在生物安全柜中将化验单和试管依次编号后，弃去外层手套。 b）双手换上新外层手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出1.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上。 c）向1.5ml离心管中加入500μl嗽口液标本或50μl阴性对照液，再加入等量浓缩液。在闭管情况下将离心管移出生物安全柜置于-20℃静置10分钟后，4℃ 12000转/分钟离心10分钟。 d）离心后标本转移至生物安全柜中去上清至剩余20～30ul。加入混匀后的RNA提取液A10ul，再用移液器加入400 μlRNA提取液B，在震荡器上震荡混匀，室温放置5分钟，然后闭管转移出生物安全柜6000转/分钟离心1分钟。 e）离心后标本转移至生物安全柜中去上清，留沉淀。加入400μl 用DEPC水配制的75﹪的预冷乙醇充分混匀，洗涤沉淀，关闭管盖。然后于生物安全柜外6000转/分钟离心1分钟，移回生物安全柜内去上清。相同方法再洗涤一次，吸干上清。然后离心管移至生物安全柜外65℃10分钟开盖烘干。 f）向烘干后的沉淀管中加入18 μl的反应液I，混匀，再加入2 μl逆转录酶，充分混匀，放入温箱，37℃45分钟逆转录。 g）逆转录后95℃3分钟高温灭活，瞬时离心（3秒），取5 μl上清立即点样上机。 h)收拾台面至准备状态，进行实验环境消毒灭菌。 粪 便 a）穿戴好隔离服等防护设备，启动生物安全柜。待其正常工作后，双手戴上第二层手套，从冰箱取出标本，在生物安全柜中将化验单和15ml带盖密封离心管依次编号。 b）向标号后的离心管中加入5ml灭菌生理盐水，用灭菌棉签挑取1g粪便置于离心管中，充分混匀。 c）标本转移至生物安全柜外3000转/分钟离心5分钟。同时另取15 ml带盖密封离心管编号。 d）在生物安全柜内取上清3ml转移至对应编号15 ml带盖密封离心管中。 e）双手换上新手套，用镊子(夹取灭菌物品专用)取出1.5ml灭菌离心管编号，置于离心管架上。 f）向1.5ml离心管中加入500μl粪便上清液标本或50μl阴性对照液，再加入等量浓缩液。在闭管情况下将离心管移出安全柜置于-20℃静置10分钟后，4℃ 12000转/分钟离心10分钟。 g）离心后标本转移至生物安全柜中去上清至剩余20～30ul。加入混匀后的RNA提取液A10ul，再用移液器加入400 μlRNA提取液B，在震荡器上震荡混匀，室温放置5分钟，然后闭管转移出生物安全柜6000转/分钟离心1分钟。 h）离心