1、是否需要交联.PDFVIP

染色质免疫沉淀（ChIP ）是目前研究体内DNA 与蛋白质相互作用的重要工具。 虽然ChIP 技术的原理不复杂，但是对技术的要求高，实验步骤的设计摸索耗时 耗力，实验耗费时间长。要成功实施ChIP 项目，请先明确下面4 个问题~ 1、是否需要交联 交联的目的是将感兴趣的抗原固定在其染色质结合位点。若没有交联的步骤，就 意味着只有与染色质结合非常紧密的蛋白质能被免疫沉淀，譬如组蛋白。若您的 研究对象是组蛋白，那可能不需要交联，而其他蛋白，如转录因子和DNA 结合 复合物中包含的蛋白，可能还需要交联。 如果使用交联，则ChIP 反应被称为X-ChIP ，则天然的ChIP 反应被称为N-ChIP 。 然而，确实有一些抗原不适合用X-ChIP 这种方式，因为在交联过程中它们的表 型会发生变化，或出现包涵体。 2 、片段化要小心 染色质必须片段化，才能让相互反应接触到抗体。无论您采用哪种方法，都必须 确保一定的片段化时间进程。对于X-ChIP ，超声波处理是必需的，因为甲醛交 联限制了酶切的效果。超声波处理的条件要自己来优化，不过说明书上通常都会 给出一个参考条件。超声波产生了随机的DNA 片段（平均500-700 bp ）。在开 展N-ChIP 时，微球菌核酸酶的消化可产生~175 bp 的单体。酶切消化的优势在 于消化的重复性好，易控制反应。 3 、抗体用对没有 如果可以的话，使用经过充分验证、ChIP 级别的抗体。当然，这种抗体并不多。 如果没有，也可以选择普通的免疫沉淀抗体，或能够识别天然表位的抗体。一般 来说，多克隆抗体是个更好的选择，因为单克隆抗体只识别单个表位，而这个表 位有可能在交联过程中被掩盖。而另一方面，单克隆抗体却往往有着更好的批间 一致性。抗体的量和使用的条件都应根据使用经验来确定。一般情况下可以从每 50ug DNA 使用2-5ug 抗体作为起始条件开始摸索。 4 、对照也很重要 作为ChIP 技术的阳性对照，H3K4me3 和H3K9me3 分别适用于激活和失活的 基因。作为阴性对照，可选择一个识别非染色质表位的抗体，如GFP 抗体。但 要记住，这些抗体本身不是阳性和阴性对照，因为这取决于您正在研究的位点。 如果在您研究的位点无H3K4me3，即使是最好的ChIP 级别的H3K4me3 抗体 也不能让任何东西免疫沉淀，那么这就不是一个理想的阳性对照。如果您的实验 室刚刚开始用ChIP ，最好考虑购买试剂盒。（转自生物通）