质粒DNA小量制备及纯化.pptVIP

实验十二 质粒DNA的 小量制备与纯化 一、实验性质：操作性 二、目的及要求： 1、了解质粒作为载体在基因工程中的应用。 2、熟记提取质粒的基本原理，学习提取过程和方法。 3、为下一步实验提供高纯度的DNA样品。 三、原理 质粒：是染色体以外能自主复制的双链、 闭合、环状DNA分子。 存在部位：广泛存在于细菌中，在一些动、 植物细胞中也发现有质粒存在。 质粒是基因工程中最常用的载体，作为载体的质粒必须具备以下 六个特点： ① 能自主复制； ② 具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并且在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能； ③ 具有1-2个筛选标记； ④ 分子量小，多拷贝，易于操作； ⑤ 是非接合性质粒，即不含有结合转移基因，在自然条件下不能从一个细胞转移到另一个细胞中去； ⑥转化效率高。 本次实验是从大肠杆菌中提取和纯化质粒，以备进一步研究之用。 从大杆肠菌中提取和纯化质粒的方法很多，但不外乎三个步骤,即 细菌的培养 细菌的收集和裂解 质粒的分离和纯化 原理如下： 1 细菌的培养 挑单个菌落接种到适当培养基中培养。通常以细菌培养液的O.D600nm值来判断细菌的生长状况。 O.D600nm = 0.4时，细菌处于对数生长期； O.D600nm = 0.6时，细菌处于对数生长后期。 由于质粒在细菌内进行复制时，往往受到宿主的控制，因此在对数生长后期可加入氯霉素， 氯霉素可抑制细菌蛋白质的生物合成和染色体DNA的复制，而质粒的复制却不受其影响因而得以大量扩增。 对于新一代的质粒如PUC质粒系列，由于宿主对其复制控制不严，所 以添加氯霉素已不十分必要。 使用氯霉素的目的: 在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和数量以降低细菌裂解物的复杂性和粘稠度。 2 细菌和收集和裂解 细菌在生长过程中，会将大量代谢物排到培养液中。为提高质粒的纯度，往往通过离心弃除培养液，再将细菌用STE溶液（ NaCl，Tris-HC1， EDTA）洗1-2次，以便尽量将培养液和细菌代谢物去除干净。 裂解细菌的方法：SDS法、碱裂解法、煮沸法 它们各有利弊，应根据所提质粒的性质、宿主菌的特性及纯化质粒的方法等因素加以选择。 本实验采用碱裂解法: （1）用EDTA破坏细菌的细胞壁和细胞外膜； （2）用SDS使细胞裂解，与此同时用NaOH提高溶液的PH值，破坏碱基配对，使染色体DNA变性成为单链DNA，但闭环状的质粒DNA因处于缠绕状态而不能彼此分开。 3 质粒的分离和纯化 在反应体系中加入酸性溶液使裂解液的PH值 恢复到中性，此时，小分子质粒DNA迅速复性为可溶性质粒DNA，小分子RNA亦为可溶状态，而变性的染色体DNA、高分子量RNA以及K+/SDS/蛋白质/膜复合物则在0℃孵育时形成沉淀，经离心可去除。 然后，再采用酚、氯仿等蛋白质变性剂抽提去除残留蛋白质，用RNase去除残留RNA，即可得到质粒的粗制品。以后，可用超速离心法、电泳法、离子交换层析法或排阻层析法等进一步纯化质粒。 5 操作步骤 5.1 将0.5ml含重组质粒pIL的大肠杆菌接 种于100ml LB培养基（含氨苄青霉素 100ug/ml ）中，37℃，150rpm振荡培 养过夜。 作用：培养细菌。加Amp的目的为使含 Amp 抗性基因的细菌选择性生长。 5.2 取 1.5ml菌液 置于 1.5ml EP管 中， 15,000rpm离心30秒(EP管开口处朝 下)，弃上清，控干。 作用：沉淀细菌。注意：控干时将吸水纸 卷成圆柱状，沿管壁轻轻吸取水 珠。控