基因工程常用工具酶.ppt

5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ BamHⅠ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ BclⅠ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ BglⅡ BamHⅠ BclⅠ BglⅡ三种酶可产生相同的5’GATC粘性末端，由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。 限制性内切酶识别特异性放宽。 EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松动，可在AATT处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做星活性，用EcoRⅠ*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。 影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。 重组DNA前的切割 构建新质粒 构建物理图谱 DNA分子杂交 用限制性内切酶消化受体DNA 制备DNA探针 亚克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究 Ⅱ类R-M系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲基化酶。 甲基化酶也称修饰酶(modification enzyme)，用来修饰限制酶的识别序列，在该序列位点的胞嘧啶（C）5-氨基上加一个甲基，使得该序列可以被限制性内切酶识别而免于切割。 甲基化酶分两类： 维持性甲基化酶：用于在新合成的DNA链上进行甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。 构建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA链上进行甲基化的酶。 用甲基化酶进行甲基化的作用 封闭DNA链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。 构建新的酶切位点 能够催化DNA中相邻的3’-羟基和5’-磷酸基团末端之间形成3′, 5′-磷酸二酯键的酶。 T4 DNA连接酶：可连接带匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的双链DNA分子相互连接。 大肠杆菌DNA连接酶：只能连接带匹配粘末端的DNA分子。 DNA连接酶需要在一条DNA链的3’－末端具有游离羟基（－OH），另一条链5’－末端具有磷酸基（－P）时才可发挥作用。 3’－OH和5’－P需彼此相邻，且各自位于与互补链上互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端。 DNＡ连接酶不能连接单链DNA分子，只能连接双螺旋DNA分子的一部分。 DNA连接酶只能封闭失去一个磷酸二酯键所出现的单链切口（nick），不能封闭失去一个或数个核苷酸所形成的缺口（gap）。 DNA连接酶反应时需要能量（NAD＋或ATP）。 切口： 失去磷酸二酯键 缺口：失去核苷酸 5‘ 3’ 3‘ 5’ 5‘ 3’ 3‘ 5’ 2.3.3.1 T4噬菌体DNA连接酶 由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，分子量68KD，需ATP。 可以连接互补的粘性末端。如： 5’…ACGOH pAATTCGT…3’ T4DNA连接酶 3’…TGCTTAAp HO GCA…5’ Mg2＋，ATP 5’…ACGAATTCGT…3’ 3’…TGCTTAAGCA…5 反应系统：ATP，Tris－HCl，MgCl2，DTE（二硫赤藓糖醇），ATP，pH7.5，4～15℃ 也可以连接两条平起末端的DNA分子，但反应速度较慢。 5’…CGAOH PCGTA…3’ T4DNA连接酶 3’…GCTP HOGCAT…5’ Mg2＋，ATP 5’…CGACGTA…3’ 3’…GCTGCAT…5’ 可以实现分子间或分子内连接。 AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ 5′ 5′ (1) (2) AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ (a)分子间连接 (b)分子内连接 (1) (2) AT G C T A TA G C T A T4连接酶 T4连接酶 2.3.3.2 大肠杆菌DNA连接酶 只催化有匹配粘性末端的DNA分子 需有NAD＋（氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）做能源辅助因子。 反应缓冲体系：Tris－HCl，MgCl2，EDTA，DTE（二硫赤藓糖醇），NAD，BSA，pH