结核分枝杆菌H37Rv的β-内酰胺酶假说的分子克隆,超表达和生物化学的特征.docVIP

结核分枝杆菌H37Rv的β-内酰胺酶假说的分子克隆，超表达和生物 化学的特征 K.M. Nampoothiri, R. Rubex*, A.K. Patel*, S.S. Narayanan, S. Krishna, S.M. Das and A. Pandey 印度,生物技术部，国家学科科学与技术学会（以前的区域研究实验室），CSIR 杂志名称：Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072 影响因子：2.09 摘要 目的：分子克隆，和来自于结核分枝杆菌H37Rv基因组的基因的超表达与生物学特征与β-内酰胺酶的活性有关。 方法和结果：对结核分枝杆菌H37Rv基因组的分析表明，Rv2068c，Rv0406c和Rv3677c基因产物进行了预测，表现出β-内酰胺酶的活性。这三个基因都用pET28a载体克隆然后在C41(DE3)大肠埃希菌细胞中进行过量表达。加标记的重组蛋白被免疫印记法证实重组成功，同时通过对头孢硝噻和其他的β-内酰胺类抗生素的水解反应证实这些重组蛋白质具有β-内酰胺酶活性。所有重组蛋白的催化参数均由酶的抑制试验所得出。用于重组菌株的抗生素敏感性试验显示其对不同种类的β-内酰胺类抗生素抵抗性的增加。 结论：研究表明在结核分枝杆菌中可能有不止一个基因编码具有β-内酰胺酶活性或类似β-内酰胺酶活性的基因，因此使得结核分枝杆菌可以广泛抵抗β-内酰胺类抗生素。 这篇研究的重要性和影响性：系统化的关于结核分枝杆菌β-内酰胺酶的假设研究，和相关的种类及β-内酰胺类抗生素的抑制试验可以对于发展新的针对肺结核引起的多重耐药的药物抵抗菌株治疗的新的抗生素很有帮助。 关键词：β-内酰胺酶，β-内酰胺类抗生素，结核分枝杆菌，头孢硝噻 前言： 分枝杆菌菌株对于抗分枝杆菌药物的抵抗性的增加和结核病在现在的死灰复燃都强调了寻找新的治疗结核病手段是非常迫切的。β-内酰胺类抗生素可以抑制细菌中的转肽酶反应和阻止细菌细胞壁的合成，所以是非常广泛的抗微生物制剂。然而大多数分支杆菌是天然抵抗β-内酰胺类抗生素，大概是因为它们的非常疏水的细胞壁，虽然其细胞质中存在青霉素结合蛋白但重要的是它同时存在β-内酰胺酶催化水解β-内酰胺类抗生素的作用。大多数的结核分枝杆菌产生β-内酰胺酶，在酶的结构上，分类上有不同，以及是否分泌细胞质或者绑定细胞膜和关于是否其产物是可诱导或是构成的。对分枝杆菌β-内酰胺酶的动力学研究大多与酶制剂不纯有关，或者与已推断间接的关于β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂的合成物的药敏试验结果有关。系统的研究结核分枝杆菌β-内酰胺酶和与其相关的种类，还有对于相应的β-内酰胺类抗生素及其抑制剂的药物敏感性实验的研究，有利于对新的抗生素制剂的发展。 来自结核分枝杆菌H37Rv的DNA文库的粘粒上的开放阅读框架和已知的A类β-内酰胺酶具有同源性，该基因从结核分枝杆菌的染色体上的DNA用PCR扩增出来，而且被Vloadri用大肠埃希菌中高表达。重组酶的动力学与直接用pI是5.1和4.9从结核分枝杆菌中提取出来的β-内酰胺酶相似，该重组酶主要表现出青霉素酶的活性。事实上，作者也提出了第二个可能性，即一小部分的β-内酰胺酶也具有相对较强的的头孢菌素酶活性。有相关报道说无毒的结核分枝杆菌H37Ra的主要的β-内酰胺酶Bla A基因与Rv2068c中的BlaC基因的生物化学结构完全相同。在耻垢分枝杆菌中的主要的β-内酰胺酶基因（Bla S/Bla A,Bla E)与偶发分枝杆菌中的A级分枝杆菌中的Bla F基因生物化学特征相似。这个结构说明Bla C具有成为用β-内酰胺类药物和β-内酰胺酶抑制剂的混合剂治疗结核的潜在的作用靶点。对于分支杆菌中β-内酰胺酶的详细分布和精确的特征是迫切需要阐述的，以便用于评估未来在治疗肺结核中β-内酰胺类药物的作用角色。很少有临床证据表明，β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂组合，如阿莫西林-克拉维酸，氨苄西林-舒巴坦，该组合在结核分枝杆菌感染的治疗过程起作用。 结核分枝杆菌基因组序列测定的完成，已经打开了通向治疗结核病的新的途径。这篇研究说明了存在有不止两种的蛋白质，除了BlaC，在结核分枝杆菌H37Rv菌株中有类似于β-内酰胺酶活性的蛋白质存在，提供了抵抗β-内酰胺类抗生素的抗普性。 材料和方法： 菌株，化学药品和试剂 pET28a载体从USA，Novagen获得，然后在从USA，Avidis获得大肠杆菌C41(DE3)的表达体系中表达。克隆的步骤在大肠杆菌Top 10细胞中进行，该细胞来源于UK在泰恩河上的纽卡斯尔大学。结核分枝杆菌H37Rv菌