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七、高效液相色谱制备色谱仪器 1、高压泵（略） 2、检测器 绝大多数商品检测器都用于分析型工作，它们存在易饱和的问题（负载量受到限制）并不适合制备型分离。一些专门为制备型分离而设计的带有样品槽的检测器也有出售，如GowMAS公司出产的80－800LC-UV检测器，其中洗脱液以薄膜形式流经石英槽（Leutert 1984），使用此检测器流速可达500ml/min。 高效液相色谱制备色谱仪器 带有0.05mm长度的样品槽的紫外检测器可承受高达200 ml/min的洗脱液流速。这种流速适合中压液相色谱分离。而我们研究半制备高效液相色谱流量一般在20－30ml之间，尤其是2－8ml之间最佳。目标化合物分离度高，分离纯化样品量也较高。例如商陆皂苷甲，收集了一个星期，得到400mg，除了作波谱分析外，还提供作药理实验。 高效液相色谱制备色谱仪器 HPLC的检测器种类不多，两种最常用的技术——紫外和示差检测器在使用上有其局限性。示差检测器当然对无UV吸收物质能检测，但对温度很敏感，灵敏度低，对少量物质检测不理想而且不能采用梯度洗脱方式。对于无紫外吸收的物质一种日益受到欢迎的检测方法是蒸发光散射检测器（ELSD）,可用于挥发性成分，并可在梯度洗脱条件下检测。该检测方法需要通过加热的方法使溶剂挥发，因此需要安装一分流装置，对易分解的成分另外收集。 也可用薄层色谱对高浓度的流出液各流分进行检测。另外也可用质谱对各流分进行定性和定量检测。 八、流动相的选择 1、流动相的选择是分离目标化合物的关键。根据，只要选择最佳配比流动相，?增加就可大大增加混合物分离度，其Rs1.25以上，有如下好处： 分离得目标化合物纯度高 上柱样品量大 收集到纯的目标化合物量多 波谱鉴定一次成功 流动相的选择 2、选择流动相分方法。例如反相C18柱，流动相如甲醇和水的比例可用0～90％梯度的方式来确定，找到最佳分离时的甲醇－水配比，然后用该比例溶剂洗脱进行样品分离、收集。 3、选择洗脱溶剂纯度要高，否则会带来杂质，干扰分离纯化。另外溶剂在末端透过率一定要高，一般来说，使用HPLC溶剂可达到上述要求，如使用分析纯甲醇，在254nm后透过率还可以，230nm时基线就会漂移。特别在梯度时更为严重。 4、流动相中非挥发性添加剂（如离子对色谱、置换色谱）会在产物回收时引起麻烦。要采用挥发性缓冲液来改进分离效果，又易于将其除去。例如，Mierzwa等（1985）利用半制备型18烷基硅胶柱，以乙腈－0.01mol/L乙酸铵（PH 4.0缓冲液）（40：60）为洗脱剂，分离得到大环内酯抗生素。 九、被分离色谱图的收集方法 1、边缘切割和循环色谱分离 当对两个多多个相距很近的主要成分进行分离时，若色谱系统的选择性不足以将该混合物分开，此时可采用循环色谱分离（Charton等1994，图5.6）。 被分离色谱图的收集方法 在确定最佳分析型分离条件后进行制备型色谱分离，通过切割相应色谱图的前部和后部可获得纯的a和b成分。利用此法，对a和b成分的混合物（循环组分）重新进行分离，可进一步获得纯品。如果一次循环分离还不能将a和b完全分离，则可重新进行循环色谱分离。实际上，循环色谱分离与增加柱长度的效果类似。 图5.6中，看到循环组分分离色谱带变宽是因泵内溶剂体积过大等柱外因素引起，应将其检测在最低限度。循环色谱分离中最先被洗脱的峰不应与上次分离中最后出的峰重叠。 被分离色谱图的收集方法 循环色谱分离需具备两个基本装置： －密闭进样 －交换柱循环 前一种是将流经检测器的色谱柱流出液通过多向阀连于泵的入口。后一种是连接两根色谱柱，使洗脱液从第一根柱直接流入第二根柱。必要时，在收集到纯的样品前，通过阀门控制，可将由第二根色谱柱切割得到的样品再加到第一根柱上。该方法的优点在于样品只流经泵一次。 2、色谱柱的过载和中心切割 为提高制备型分离能力，可使色谱柱超载（含量和浓度超载，非容积超载），由于分离不是在线性条件下进行，最佳的分离条件无法再从分析型数据来控制。在利用“中心切割”技术进行分离时，需避免主要色谱峰前后两端微量组分的污染（图5.7）。 被分离色谱图的收集方法 被分离色谱图的收集方法 用这种方法进行分离，可能损失少量a，但a的产量却可提高。在实际分离过程中，可逐渐加大上样量直到达到适当的超载程度，并通过中心切割得到一个不受色谱峰前后杂质的污染的产物。 为了达到最大承载目的，样品应尽可能溶在比流动相溶解能力差的溶剂中。 被分离色谱图的收集方法 Farma Kalidis 和Murphy（1984）利用中心切割法，从大豆中分离异黄酮类成分染料本苷genistin和大豆苷deidzin。如图5.8所示，通过切割超载上样的色谱得到一富含a的成分，对其进行一次分离即可得到纯化合物a。