质粒DNA提取原理、步骤、凝胶电泳分析及其应用.pptVIP

质粒DNA提取的原理、操作步骤、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 质粒DNA的提取 Extraction of Plasmid DNA 独立于细菌染色体外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子； 存在于细菌，放线菌，真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多． 质粒（Ｐlasmid） 定 义 质粒能自主复制，在细菌中不断复制自身。在细胞内的复制分成两种类型：一种是低拷贝数的质粒，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，这种类型称为“严谨型”复制的质粒；另一种是高拷贝数的质粒，拷贝数一般在20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒 质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（如抗氨苄青霉素、抗四环素等），耐受重金属，产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了这些额外的特性 碱裂解法 煮沸裂解 羟基磷灰石柱层析法 质粒DNA释放法 酸酚法等 方 法 选择哪一种方法主要取决以下几个因素： 质粒的大小 大肠杆菌菌株 裂解后用于纯化的技术和实验要求 分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离质粒DNA 分离质粒DNA三步曲 分离 质粒 收集 裂解 细菌 质粒 扩增 基本步骤 基本原理 1、碱裂解法 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； 高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性； 当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉定去除； ☆原理示意图 操作步骤 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到5~10ml液体培养基中，37 ? C震荡培养12~16h，到细菌浓度远超过对数生长期时收获菌种。 吸取1.5mL培养物加入1.5mL离心管中，4 ? C 12000r/min室温离心1min 小心吸去培养液，将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽(细菌沉淀尽可能干燥) 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀(涡旋振荡)，室温放置10min 加入200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧盖子，快速温和颠倒离心管数次,以混匀内容物 (千万不要振荡),冰浴3分钟 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧盖子，颠倒数次使混匀。冰上放置3~5min 12000r/min离心15min，将上清转至另一离心管中 向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24:1），反复混匀，12000r/min离心2min，将上清转至另一离心管中 向上清中加入2倍体积异丙醇，混匀后，室温放置2min， 12000r/min 离心1min. 倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡，12000r/min离心30s，倒去上清液，空气干燥10min 加40μLTE（含40μg/mL胰RNA酶），使质粒DNA完全溶解，－20℃保存 菌体老化 碱裂解不充分 菌体中无质粒 溶液使用不当 请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养 可减少菌体用量或增加溶液的用量 不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。 溶液Ⅱ在温度较低时可能出现浑浊，置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液。 问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 原因 对 策 常见问题 混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA 不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 加入RNaseA室温放置一段时间 加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。 问题二：质粒纯度不高，如何解决？ 原因 对 策 常见问题 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5000 bp 3000 bp 2000 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp M: DL5000 DNA Marker 1, 4,7,10 为质粒DNA 2, 5,8,11 为PCR产物 3, 6,9,12 为酶切片段 酶切长片段 含目的DNA片段的酶切短片段 实验结果 琼脂糖凝胶电泳的应用 1、DNA的制备 ⑴ 适合分离大片段DNA。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。 ⑵ 可提取大分子DNA。在“洋葱帕克霍尔德氏菌HMW·DNA的制备及