离心分离技术.pptVIP

5、密度梯度的制备（手工、梯度混合仪、离心形成法） 预形成梯度：手工法、梯度混合仪法 此方法要事先制备密度梯度，常用的梯度介质主要是非离子型的化合物(如蔗糖、甘油等)。离心时把样品铺放在梯度介质的液面上，这个密度包括了所需要研究的密度范围，直到粒子的漂浮密度和梯度的密度相等时，粒子才发生沉降，并排列成不同的区带。 用这一技术可以定量的从线粒体和过氧化物酶体中分离溶酶体。 (1) 阶梯梯度： 用手工由底部向上分层加入渐浓的介质溶液，由于扩散作用可自然形成连续梯度。扩散时间还受温度、阶梯厚度、阶梯密度差的影响。 (2) 混合梯度法： 借助梯度混合仪或自动梯度仪，可自动调节梯度斜率、形状、浓度，还可同时制备几个梯度。制成的梯度放置过久，梯度形状、斜率会变化。 梯度混合器 三种梯度形成示意图 a 线性梯度 b 凸形梯度 c 凹形梯度 High density solution Low density solution 自形成梯度：（3）离心平衡法 自形成梯度的等密度离心(平衡等密度离心)。平衡等密度离心常用的梯度介质有离子型盐类如铅盐或铷盐和三碘化苯衍生物等。离心时是把密度均一的介质溶液和样品混合后装入离心管中，通过离心自形成梯度，让粒子在梯度中进行再分配。离心达到平衡后，不同密度的粒子在梯度中各自分配到其等密度点的特定位置上，形成不同的区带。 四、离心操作 (一)加样和离心： 1. 样品准备： 离心前先除去样品中大颗粒和胶状不溶物。 要求样液密度梯度最大值（速度区带离心）。 样液中含有低浓度盐（如0.2M NaCl）可消除组分颗粒间电荷影响（减慢速度降低分辨率）。 样品中需加缓冲剂或保护剂，如酶底物、EDTA等或Ca2+、Mg2+离子。 2. 加样： 顶部加样——沉降差速区带离心； 底部加样——漂浮差速区带离心； 中部加样——平衡等密度离心（等密度区带离心）； 混合加样——平衡等密度离心； 差速区带离心：样品须少（5%梯度总体积），样品不太浓（90%梯度最小浓度）。 严格按使用说明操作。 样品管要充满且配平； 超离心须在低温、真空下进行； 加速、减速须缓慢； 防止扰动梯度和区带，降低分辨率； 平衡等密度离心时，转速不能过高。 3.离心： (二) 梯度的回收 1. 底部收集法（穿刺法）：用一根金属空心针从离心管底刺人管内，不同区带内的组分自下而上地先后从针管内分别流出，然后用部分收集器分别收集。从高密度开始收集。 2.?顶部收集法：不破坏离心管。 取代法： 向上取代法：注入高密度液体； 向下取代法：注入低密度液体。 虹吸法：靠负压依次吸取梯度液。 3. 切割法：粘度大时上述方法不适用。 冻结切割法； 聚合切割法。 (三）梯度分析: 测定梯度浓度意义 梯度测定法 样品测定 （四）离心制备的步骤: 组织---匀浆---过滤---分级离心----梯度离心 （五）制备超离心注意事项: 注意平衡 查阅目的物信息 超离心设备 美国BECKMAN（J6系列） 超高速离心机 离心操作的注意事项 高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。 超速冷冻离心机:未经过培训和考核者不能使用。 其它普通离心机：按照操作要求进行。 1.使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。 2.离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。 3.若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。 4.装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。 5.离心过程中不得随意离开