感受态细胞的制备转化课件.ppt

感受态细胞的制备、转化 实验（二）结果 感受态细胞的制备、转化 实验目的： 掌握大肠杆菌感受态细胞制备及转化的原理; 熟悉实验的具体操作步骤。 实验原理： 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞才能大量的进行复制、增殖和表达。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 Cacl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于零度、Cacl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。 转化子的筛选 1.抗生素筛选法：AMP抗性 2.蓝白斑筛选法： 当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。 用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz‘的基因，lacz’中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA 的选择性插入位点，一旦有外源DNA插入到MCS中， lacz‘就发生插入突变，不能表达， X-gal将不能显蓝色，而形成白色菌落，肉眼可藉此分辨。 实验步骤 （一）感受态细胞的制备——均需在冰上操作 1. 取菌液1.5ml于Ep管中，冰浴10min后，4℃离心， 4000rpm,10min,去上清液，收集菌体。 2. 将0.5ml预冷的0.1mol ∕L Cacl2轻轻悬浮细胞，冰浴15min。 3. 4℃离心， 4000rpm,10min。 4. 弃上清，加入50ul预冷的0.1mol ∕L Cacl2，小心悬浮细胞。 5. 将制备好的感受态细胞放冰上进行下一步试验。 （二） 感受态转化鉴定 1. 在上述Ep管中加入10ul连接反应液，温和混匀（轻度摇晃），于冰上放置30min(Ep管和移液器枪头要提前预冷）。 2. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90s，然后将Ep管迅速转移到冰浴，冷却3min. 3. 向管内加入400ul的LB培养液，然后37℃100rpm振荡培养45min。 4. 取100ul的转化细胞转移到含有Amp抗生素、IPTG和X-gal的LB固体平板上，用灭菌棒涂布均匀。室温放置几分钟，然后倒置放入37度恒温培养箱过夜，观察是否有菌落。