外源基因在宿主细胞中的表达终稿上课.ppt

1984年，日本学者Maeda用家蚕核型多角体病 毒（BmNPV）在家蚕中表达α－干扰素，其表 达量比当时其它真核表达系统高出３个数量级 3.家蚕生物反应器 家蚕作生物反应器独特的优点: （1）家蚕易于饲养、成本低廉 （2）外源基因表达效率高，可进行分泌型表达 （3）表达产品后加工容易 （4）安全、可靠、对人畜无毒性 （5）表达产物有生物学活性。 缺点： 外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下, 而这时由于病毒感染,细胞开始死亡 Thanks！ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 基因工程真核宿主系统 真菌（Fungus ) 昆虫(Baculovirus ) 高等真核细胞（Eukaryotic) 动、植物（基因农场） 酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。 外源基因在真核细胞中的表达 真核或病毒启动子 MCS PolyA信号 终止子 外源基因 （1）优点 ①能够识别和除去外源基因中的内含子，剪接形成成熟的mRNA； ②真核细胞可将表达的蛋白糖基化等进一步修饰 （2）缺点 ①选择标记和选择系统少； ②转化效率低； ③外源基因导入细胞染色体上带有一定的自发性和盲目性，整合的拷贝数和位置都不能控制； ④细胞培养技术性强、成本高、手续繁琐费时等。 一、真核细胞基因表达系统的特点 二、真核细胞表达载体的功能元件 １、启动子元件 ２、增强子元件 ３、加poly（Ａ）信号 ４、mＲＮＡ的剪接信号 ５、与翻译相关的元件： ６、用于复制和选择的元件 ① 能在E.coli中克隆和扩增。 1. 酵母克隆载体 三、在酵母中表达 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; ③ 有酵母的选择标记 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells 面包 酵母 2. 表达外源基因的酵母宿主菌 ①酿酒酵母 ②巴斯德毕赤酵母 ③乳酸克鲁维酵母 用作模式真核生物的酵母宿主菌，用作外源基因表达的酵母宿主菌 诊断试剂 丙肝病毒蛋白 HIV-1抗原 种类 名称 疫苗 乙肝病毒表面抗原 疟原虫环子孢子蛋白 HIV-1外壳蛋白 在啤酒酵母中表达的重组蛋白 人类治疗用蛋白药物 上皮生长因子 胰岛素 类胰岛素生长因子 血小板源生长因子 胰岛素前体 成纤维细胞生长因子 集落刺激因子 ?1抗胰蛋白酶 凝血因子VIIIa 用原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达 系统来表达糖蛋白生物药物，或是不可能或是不 完全。因此目前已经投放市场，以及正在进行临 床试验的治疗用蛋白质生物药物70%来自哺乳动 物表达系统。 四、哺乳动物细胞高效表达系统 举例 EPO（红细胞生成素）用原核系统进行表达，缺少可用以进行糖基化的结构和机制，所以表达的产物不能发挥应有的生物活性。 酵母、昆虫或植物表达的产品可以糖基化，但这类细胞的糖基化酶不同，因而表达产物的寡糖链末端多为甘露糖、N-羟基乙酰神经氨酸和半乳糖，易被肝细胞、巨噬细胞表面的受体识别而清除。故此类产品可能对人有免疫原性。这也是为什么昆虫细胞表达系统，尽管表达的产品有300多种，表达量也很高但其产品却迟迟得不到批准的主要原因。 （一）哺乳动物细胞表达系统的特点 1.优点： 目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白 的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组 装成多亚基蛋白 哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中 达到高密度且培养体积能达到1000L以上 哺乳动物细胞的表达水平低 获得高表达细胞株所需的时间长 细胞大规模培养的成本高 哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高 2.缺点： （1） CHO细胞：中国仓鼠卵巢细胞，1957年，Puck中国仓鼠卵巢中分离而来的 。CHO是目前最成功的生物制品表达宿主细胞。 1.常用于真核表达的细胞系： （二）哺乳动物细胞表达系统的构成 使用该细胞生产并已投放市场的重组生物药品有组 织型纤溶酶原激活剂（tPA）、用于肾力衰竭和艾 滋病中增升红细胞的EPO，预防乙型肝炎感染的乙 型肝炎表面抗原疫苗等 （2）COS细胞 （3）BHK-21：1961年从地鼠幼鼠的肾脏分离而来 用它表达的重组凝血因子VIII已获准投放市场 （4）C127细胞：来自RIII小鼠肿瘤细胞，特别适用于带有牛乳头瘤病毒（BPV）载体的转染 成果：用C127细胞生产的重组人生长激素（hGH） 已获准投放市场，用于治疗生长激素缺乏症 （5）MDCK细胞：1958年从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得的 （1）病毒载体：以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内