原生质体培养与诱变.ppt

第6章 原生质体培养与诱变 §6.1 原生质体培养 ? 原生质体分离纯化 ? 原生质体鉴定与活力测定 ? 原生质体培养与植物再生 ? 原生质体概念与特征 原生质体的概念、特征及意义 ? 概念： – 除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体 ? 特征： （1）除去细胞壁的原生质体，便于摄取外源DNA、细菌等物质，为基因转移和细胞工程遗传操作提供了良好材料； （2）具有全能性，可再生成完整植株； （3）利于通过细胞融合形成杂种植株，培育新品种，特别是克服种间不亲和障碍。 植物原生质体 蔡司confocal镜下拟南芥原生质体中叶绿体内膜（红光）、叶绿体蛋白-GFP（绿光） 纯化后的叶肉原生质体 植物原生质体培养意义 信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理 融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体 1、原生质体材料来源 ★ 植物叶片 －取材容易 －比较容易用酶解法分离 ★ 植物根尖组织 －可由各种植物的种子萌发后取得 ★ 植物花粉 －产生单倍体原生质体 ★ 愈伤组织、悬浮培养的细胞 －细胞壁容易解离 1.1 原生质体分离纯化 2、原生质体的分离方法 ★ 机械分离法 －先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分 离，原体质体收缩成球形式，再用机械法磨碎细胞，从伤 口处可以释放出完整的原生质体。 －优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。 －缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。 ★ 酶解分离法 – 常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶 酶、琼脂酶、果酸酶等 – 优点： 条件温和，原生质体完整性好，活力高，得率高。 几乎所有植物器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。 – 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及 酚类物质，影响所获原生质体的活力。 举例:不同植物原生质体分离所用的酶液和质膜稳定剂 ▲ 烟草叶肉细胞：0.5% Macerozyme R-10果胶酶+2% Onozuka R-10纤 维素酶，0.7M 甘露醇。 ▲ 烟草悬浮细胞： 2% Driselase纤维素酶+2% Cellusase纤维素酶+ 0.5% Macerozyme果胶酶；海水。 ▲ 胡萝卜悬浮培养的细胞： 2% Onozuka纤维素酶+0.5% Driselase纤维 素酶+0.5% Rhoxyme半纤维素酶1% Pectinase果胶酶；0.35M甘露醇 + 0.35M 山梨醇 ▲ 甘蓝等的根细胞：4% Maicelase纤维素酶+2% Rhozyme半纤维素酶 +0.3% Macerozyme果胶酶； 0.7M 甘露醇。 ▲ 番茄无菌苗的子叶和叶肉细胞：1.5% Cellulysin 纤维素酶+0.3% Macerozyme果胶酶；102.6g/L 蔗糖。 ▲ 水稻种子的愈伤组织的悬浮培养细胞：2% Onozuka Rs 纤维素酶+1% Driselase 纤维素酶+2% Macerozyme R-10果胶酶+1% Pectolyase果 胶酶 ；0.3M 葡萄糖 3、原生质体的纯化 ? 指去除破碎的原生质体、未去壁的细胞、细 胞器及其他碎片等杂质，并与酶液分离。 (1) 过滤离心法 (2) 漂 浮 法 (3) 沉降法和漂浮法 3、原生质体纯化方法 (1)过滤-离心法 用40~100μm网筛过滤除去细胞团、未去壁细胞及碎片，再在适当介质下离心3-4次，收集得到的原生质体。 (2) 漂浮法 原生质体比重小，能在一定渗透压如25%蔗糖溶液中漂浮，用吸管收集即可，纯度高，但损失较多。 (3) 沉降法和漂浮法相结合 先低速离心，将原生质体悬浮于21%蔗糖溶液中，离心，吸取表层原生质体（漂浮法）。再重新悬浮、离心，收集底部沉淀即为高纯原生质体。重复2-3次。 烟草叶肉细胞原生质体离心漂浮法分离纯化流程 6.1.2 原生质体鉴定与活力测定 （1）低渗爆破法 把纯化后原生质体放到低渗透压洗涤液中，显微观察原生质体是否会吸水胀破：原生质体胀破后是不留残迹的，而含有细胞壁的细胞残迹保持半圆形壁。 1、原生质体鉴定 目的是检验原生质体去壁后的纯度。 （2）荧光染色法 用0.01%荧光增白剂如FDA对纯化后的原生质体染色5-10min，离心除去多余染料，用荧光显微镜在366nm紫外光下观察有无荧光：发出黄绿色荧光的表示细胞壁没去除。 2 原生质体活力(性)测定 （1）荧光素双醋酸盐（FDA）染色法 在载玻片上各加1滴原生质体悬浮液和0.1%酚藏花红溶液，不着色则具有活性，着红色的为死亡原生质体