第2讲 细胞培养课件.ppt

* 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清） RPMI1640：RPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培养。 MEM：最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。 DMEM：是在MEM培养基的基础上研制的，高糖型（4500mg/L）和低糖型(1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等 M199：主要用于鸡胚成纤维细胞培养 * FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS乃错误的使用字眼， 请不要再使用 使用浓度：一般为5～20％，最常用是10％。 * Gibco公司细胞培养的介绍 * * 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类，如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 细胞在体内、外的粘附方式存在差异 体内：粘附是全方位 ，立体的 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 * 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类，如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 细胞在体内、外的粘附方式存在差异 体内：粘附是全方位 ，立体的 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 * * 与体内上皮区别：体内：单层扁平，单层立方，单层柱状，假复层柱状纤毛，变移，复层扁平。体外：一种，不再区分。 * 是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。 HUVECs人脐静脉内皮细胞 骨髓间充质干细胞 * 游离期： 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。 吸附期： 贴附底物，一般24小时内贴壁。 潜伏期： 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制、密度依赖性 * 糖蛋白识别了这种信息,就会使细胞停止继续繁殖。 恶性细胞(malignant cells)对密度依赖性生长抑制失去敏感性，因而不会在形成单层时停止生长，而是相互堆积形成多层生长的聚集体，这种现象也说明恶性细胞的生长和分裂已经失去了控制，调节细胞正常生长和分裂的信号对于恶性细胞不再起作用。 * 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类，如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 细胞在体内、外的粘附方式存在差异 体内：粘附是全方位 ，立体的 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 * KU812：人嗜碱细胞性白血病细胞系； K562：人慢性红白血病细胞株；悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮 * 当细胞冷到零度以下，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂 * 20%血清培养基和10% DMSO（或10％甘油） 低温保护剂 * 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 ℃ ～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右） 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上 低速离心10分钟； 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 * 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。 它被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡的细胞的细胞膜。碘化丙啶 甲臢za，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 * 细胞培养常见的污染 * 瑞氏染色 * 体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。 * 真菌污染后，细胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。 真菌污染 白色念珠菌污染 真菌污染 霉菌污染 荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体 支原体污染 细胞营养液仍清亮但变黄，细胞生长变缓，部分细胞发生脱落，细胞间隙可见铺满细沙样小点。 附于胞质上的黑点为支原体 支原体污染 扫描电镜法显示支原体（细胞表面众多圆形颗粒） 6.2 无菌操作技术 【培养前准