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实验二酶活力测定方法的研究 ——生物122吕越1203070208 研究背景及目的 酶是具有生物催化功能的高分子物质。在生物体内，酶发挥着非常广泛的功能，而酶的活性则是影响各种酶功能的一个重要的指标。对于此次研究对象小麦来说，种子萌发过程中淀粉酶的活性更是与糖化力、麦种的优劣有着极其密切的关系[1]。本次试验旨在完成禾谷类种子-小麦萌发过程中淀粉酶活力的测定并分析测定结果的合理可信与否。 原理 淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。禾谷类种子的萌发时可快速将支链淀粉转变成葡萄糖，由此我们推断禾谷类种子中存在不止一种淀粉酶。通过阅读资料[2]，整理出如下表格： 催化机理 合成时期 钝化条件 α-淀粉酶 内切酶，可以水解淀粉内部任何部位的α-1,4-糖苷键 种子萌发过程 pH3.6以下 β-淀粉酶 外切酶，从淀粉的非还原末端依次水解一个个麦芽二糖，但不能越过已经存在的α-1,6-糖苷键继续切割 种子形成时 高温 在萌发的种子中，这两种淀粉酶同时存在。想要测定其中一种酶的活性，就要设法钝化另一种酶。 该实验的总体思路为精确控制酶促反应的条件，保持其处于最适条件，测定酶促反应的初速度来表示酶的活力。通过3,5－二硝基水杨酸比色法确定催化产麦芽糖的含量。 仪器与试剂 1.仪器：低速离心机（飞鸽牌，TDL-40B，上海安亭科学仪器厂）722分光光度计（上海分析仪器总厂）；40℃水浴锅（DK-S24，上海精宏实验设备有限公司）；70℃水浴锅（电热恒温水浴锅，天津市中环科技开发公司）；架盘药物天平（HCTP12A1，北京医用天平厂制）；微量可调手动移液器(大龙牌)；具塞试管（15ml）;研钵；50ml容量瓶；100ml容量瓶。 2.试剂：pH5.6的柠檬酸缓冲液；3,5-二硝基水杨酸溶液;麦芽糖标准液（1mg/ml）；0.4MNaOH；试剂甲；试剂乙；牛血清蛋白标准液（250μg/ml） 3.材料：萌发的小麦种子（苗长约1cm） 实验步骤 样品制备 称取2克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置于研钵中加少量石英砂、蒸馏水，研磨成匀浆，少量多次转移到50ml容量瓶中至40ml左右，浸提15-20分钟，用蒸馏水定容到刻度，混匀后3500转/分离心20分钟，取出上清液备用。 蛋白含量测定 标准曲线的测定 管号 F1 F2 F3 F4 F5 F6 250μg/mLBSA(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 dH2O(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 试剂甲 上方试剂加入后同时加入，各5mL，混匀，室温至少反应10分钟 试剂乙 同时加入各0.5mL，立即混匀，室温反应30分钟开始测量，2小时内结束测量 用分光光度计在650nm波长下进行比色，记录消光值，2.2蛋白质样品的测定 管号 Y1 Y2-1至Y2-3 Y3-1至Y3-3 Y4-1至Y4-3 Y5-1至Y5-3 Y6-1至Y6-3 待测液(μL) 0 50 100 200 400 800 dH2O(μL) 1000 950 900 800 600 200 试剂甲 上方试剂加入后同时加入，各5mL，混匀，室温至少反应10分钟 试剂乙 同时加入各0.5mL，立即混匀，室温反应30分钟开始测量，2小时内结束测量 用分光光度计在650nm波长下进行比色，记录消光值。根据标准曲线，进行结果计算。 酶活测定 α-淀粉酶活性的测定： 试剂试管编号 试剂 α-1 α-2 α-3 α-4 测定管 对照管 酶提取液 各1ml，在70℃水浴中准确加热15min（使β-淀粉酶钝化），取出后立即在冰浴中冷却 pH5.6的柠檬酸缓冲液 各1ml，然后再40℃恒温水浴中准确保温15min 0.4MNaOH溶液 各4ml 将试管至于40℃恒温箱水浴15min 淀粉溶液 各2ml，混匀，立即置于40℃水浴中准确计时5min 0.4MNaOH溶液 加入4ml 各取1ml反应以后的溶液，放入15ml具塞刻度试管中 3,5-二硝基水杨酸 各1ml，摇匀，在沸水浴中准确保温5min，取出冷却 蒸馏水 将每支试管中的溶液稀释到15ml，混匀 α-淀粉酶及β-淀粉酶总活性的测定： 取酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。 试剂试管编号 试剂 Z-1 Z-2 Z-3 Z-4 测定管 对照管 酶提取液、pH5.6的柠檬酸缓冲液 每个试管，两种液体各1ml，在40℃恒温水浴中准确保温15min 0.4MNaOH溶液 各4ml 淀粉溶液 各2ml，混匀，立即置于40℃水浴中准确计时5min 0.4MNaOH溶液 加入4ml 各取1ml反应以后的溶液，放入15ml具塞刻度试管中 3,5-二硝基水杨酸 各1ml，摇匀，在沸水浴中准确保温5min，取出冷却 蒸馏水 将每支试管中的溶液稀释到15ml，混匀