BS-83滤液活性对真菌对峙.doc

實驗日期:103/12/23~104/01/19 標題: 叢枝菌感染玉米之培養繁殖 第5組章懷升林辰儒林昀澍陳品全楊佑彬蔡亞修 2015/01/20 實驗摘要 大型樹林在移植時需斷根處理，處理後常發生根系生長不良，進而導致樹木死亡。叢枝菌根菌主要擁有促進植物根系發展，並具有固磷效果，可以有效改善並增加樹林移植存活率，這種菌類常見於松樹根系內，但由於松樹根系生長較緩慢且植株較昂貴，所以我們改以生長速度快，生命力強的玉米進行叢枝菌根菌的寄生。 實驗目的 1.利用玉米作為寄主，使菌感染玉米根部，進而觀察在不同比例帶菌土的混和下，玉米的生長情形，找出最適合的混和比例 2.將6組樣本分別作染色切片，觀察每一樣本的感染情況 前人研究(背景資料) 近年來由於生物肥料使用推廣，在內生菌根菌方面已實際應用於洋香瓜及西瓜之育苗，將內生菌根菌與育苗之介質或泥土混合置於穴盤或育苗袋上，有助於幼苗之成活率且瓜苗健旺根部發育佳，可提早一星期採收，果實品質顯著提高，同時磷肥之施用量亦較不接種菌根菌之處理減少一半以上，生產成本因而降低，進而增加收益。 材料與器材 樣本培養: 1.帶菌之土壤及菌根(五葉松)?玉米種子?培養土?穴盤 2.培養基?手術刀?鑷子?無菌水?75%酒精?3N次氯酸鈉(無菌培養) 切根染色: 1N HCl?2.5N KOH?染色劑(100ml甘油+90 ml水+10ml 1N HCl +0.1g甲基藍)? 75%酒精?無菌水 試管?燒杯?加熱器?溫度計?鑷子?手術刀?載玻片?顯微鏡?磁石?滴管 菌株培養 1.無菌栽培:作為對照組，幫助我們了解玉米本身之結構 2.先栽培後感染:先以培養土將玉米培養到根系開始發展(約二~三週的時間)再將原本的土 依比例 (100%，50%，25%，0%)換成帶菌之介質，日後再觀察生長情況 3.直接種於帶菌介質中:這是嘗試玉米若直接在帶菌介質中栽培是否可得到更好之結果， 依比例(100%，50%，25%)種植 (結果：本身介質不適合玉米生長，所以效果不佳。) ※本次實驗取上方標藍色記號的五組及松樹的菌根共六組來做感染觀測 實驗方法 無菌栽培:1.先將玉米種子用清水沖泡過 2.用酒精擦拭種子表面 3.配置3%次氯酸鈉 4.準備2瓶無菌水 5.將玉米種子放置錐形瓶並加入次氯酸鈉 6.搖至瓶內充滿泡泡 7.進入無菌操作台，將瓶內的次氯酸鈉倒掉 8.並加入無菌水搖至種子表面無次氯酸鈉殘留(泡泡) 9.等待種子稍微晾乾後即可以接種 切根染色:1.用清水將根洗淨 2.將根放入試管中，加入2.5N KOH (淹過根頂部)，以水浴法90oC煮10~20分鐘 (視材料根之軟硬而增減時間) 3.倒出KOH，並以清水沖洗三次 4.以1N HCl ，酸化五分鐘 5.倒出HCl，加入染色劑，以水浴法90 oC煮5~10分鐘 (視材料根而增減時間) 6.倒出染色劑，以75%酒精將染劑洗去 7.切片，在顯微鏡下觀察 可能導致實驗失敗(找不到菌)的原因 1.感染時間不夠.菌尚未感染至寄主根部 2.所採之土壤本身就不帶有所要菌種 3.顯微鏡放大倍率不足，無法觀測到菌 4.樣本切片太厚，使顯微鏡觀測不到 5.栽培方式，環境(濕度、溫度、介質)不利於菌種生長 6.染色過程錯誤，將該菌種消滅導致觀測時找不到 7.寄主選擇錯誤，菌根無法感染寄主 8.染色時間不夠或太久導致觀測不到菌種 實驗記錄 植株生長情形: 植株生長情形: 1/4混合比例生長最好，純原土因原土介質為沙質及碎石組成，不適合玉米生長所以生長明顯較其他的樣本緩慢 植株根系比較: 植株根系比較: 在根系發展的部分，則是由1/4的樣本發展最好且有明顯的白色絲狀菌絲，純原土的樣本根系就較為緩慢，純培養土的根系也發展得不錯，但就找不到白色菌絲 純原土樣本切片染色可以發現少數的菌體1/2混合比例樣本切片染色可以發現少數的菌體1/4混合比例樣本切片染色菌體數量明顯較多 純培養土樣本切片染色沒有菌體的發現 無菌培養樣本切片染色沒有菌體的發現且因為根系較纖細，染色的顏色明顯較深 原根(松)樣本切片染色由於解頗顯微鏡放