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WB的原理、操作及注意事项 原理： 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测， 蛋白质的 Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定 的特异敏感等多种特点，可检测到低至 1～ 5ng（最低可到 10－ 100pg）中等大小的靶蛋白。一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 组织： 组织的处理方法： 组织洗涤后加入 3 倍体积预冷的 PBS，0℃研磨，加入 5× STOPbuffer ， 180W，6mins ，0℃超声波破碎， 5000rpm，5mins 离心，取上清。加入 β -ME(9.5ml 加入 0.5ml) ，溴酚蓝（ 9.5ml 加入 0.5ml ）煮沸 10min，分装后于 -20 ℃保存，用时取出，直接溶解上样。 细胞： 细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入 5× STOPbuffer ，收集， 180W，6mins ，0℃超声波破碎， 5000rpm，5mins 离心，取上清。加入 β -ME(9.5ml 加入 0.5ml) ，溴酚蓝（ 9.5ml 加入 0.5ml ）煮沸 10min，分装后于 -20 ℃保存，用时取出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例） ： 直接收集分泌液，加入 β-ME、溴酚蓝制样。 B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 双缩脲法： 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。 在需要快速， 但不很准确的测定中， 常用此法。 硫铵不干扰显色， 这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。 双缩脲法的原理是 Cu2+与蛋白质的肽键， 以及酪氨酸残基络合， 形成紫蓝色络合物， 此物在 540nm波长处有最 大吸收。 双缩脲法常用于 0.5g/L ～ 10g/L 含量的蛋白质溶液测定。 干扰物有硫醇， 以及具有 肽性质缓冲液，如 Tris 、Good 缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积 10%冷的三 氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的 1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量 测定。 2.Lowry 法： 此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即 Cu++与蛋白质在碱性 溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷 - 磷钨酸试剂（福林 - 酚试剂），结果得到深 蓝色物。 此法比双缩脲法灵敏得多， 适合于测定 20mg/L～ 400mg/L 含量的蛋白质溶液。 其干 扰物质与双缩脲法相同， 而且受他们的影响更大， 硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重 偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性 pH 环境中才稳定，上 述提到的还原反应只有在 pH10 时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的 Cu2+-蛋白质溶液 中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸 - 磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被 Cu2+- 蛋白质络 合物所还原。 紫外吸收法： 大多数蛋白质在 280nm波长处有特征的最大吸收， 这是由于蛋白质中有酪氨酸， 色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故， 因此， 利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干 扰物质的存在， 在 280nm处的吸收可用于测定 0.1 ～ 0.5mg/ml 含量的蛋白质溶液。 部分纯化的蛋白质常含有核酸， 核酸在 260nm波长处有最大吸收。 有核酸时， 所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算： 是蛋白质溶液在  280nm波长处（光程  1 厘米）测得的光密度值。  是 蛋白质溶液在 260nm小波长处（光程 1 厘米）处所测得的光密度值。 此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时） 得出来的。 因此，对其他蛋白质和其 他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为 0.1%的各 种蛋白质在  280nm 处的消光系数（  ）在  0.5 ～2.5  之间变化。 所有的蛋白质在 230nm 以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的 α 0.1%在 225nm 215nm处分别为 5.0 和 11.7 ，而在 280nm处测为 0.58 。在 230nm以下的强吸收是由于肽 键的存在， 因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。 从 215nm和 225nm处的光密度之差可用于测定浓度为 10μ l/ml ～ 100μ l/ml 的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到： 光密度之差求 得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。 但是， 蛋白质之间的分子量差异比较 大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因 pH 改 变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。 4. Bradford 比色法： Bradford 比色法比 L